研究背景:中药三七(Panax notoginseng)在中医药记载已有千年历史,自古至今广泛应用于临床,尤其在外科外伤领域具有独特的消肿和抗炎疗效,被誉为“外科金疮圣药”。目前非常热门的中药产品如云南白药和片仔癀,其主要成分实际上都是三七。尽管三七的抗炎消肿疗效得到公认,且我们的课题组在前期的细胞实验研究中发现,三七可以促进中性粒细胞向炎症部位的趋化,并促使激活的炎性中性粒细胞发生凋亡。然而,三七的作用机制和原理仍不清楚。因此,本课题计划使用与人类基因相似度达87%的活体斑马鱼作为实验动物,利用斑马鱼身体透明的特点,观察三七对斑马鱼体内中性粒细胞的生理和病理影响,利用现代研究手段,探究中药三七的作用机制和途径。研究目的:本研究旨在通过使用带有多种特殊荧光标记的斑马鱼幼鱼胚胎作为实验动物模型,实现以下目标:1.探究中药三七对斑马鱼中性粒细胞的表型研究;2.研究三七对斑马鱼中性粒细胞的特异性作用;3.探究三七对斑马鱼中性粒细胞死亡的方式;4.探索三七产生抗炎作用的分子机制或通路;5.确定三七发挥最佳抗炎疗效的治疗浓度,以开发中药三七的新药用治疗场景。三七临床上长期以来广泛应用于治疗各种疾病,尤其是外科疾病中的跌打损伤等。根据中医理论,三七常被用于治疗具有炎症的疾病,如外伤出血、骨折、胸腹刺痛和跌打肿痛。近年来,通过现代技术,对三七的研究逐步揭示了其化学成分和药理活性。植物化学研究确定了三七中的多种生物活性化合物,包括黄酮、皂苷、氨基酸和挥发油等。其中,三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)是其主要生物活性成分,是从三七植物根部提取的多种皂苷的混合物,其药理特性已广泛研究。三七已被发现具有强大的抗炎治疗作用,而关于其抗炎作用物质的研究主要基于PNS中的各种成分。同时,直接使用PNS也可有效缓解与炎症相关的疾病。然而,其作用机制仍需进一步研究。目前的证据表明,PNS有望成为治疗炎症及相关疾病的前景药物。由于PNS成分的复杂性以及现有提取工艺的相对落后,还需开展更多研究以充分了解其有效成分、影响治疗的潜在机制,并确定或开发其未来的应用场景,同时确保其安全性。为实现上述目标Colforsin IC50,本研究计划利用带有特殊荧光标记的斑马鱼幼鱼胚胎作为实验动物模型,通过观察斑马鱼中性粒细胞的变化,深入研究三七的作用immune surveillance机制。斑马鱼作为模型生物具有透明胚胎的特点,可清晰观察到三七对中性粒细胞的生理和病理变化。我们将运用现代研究手段,研究三七对斑马鱼中性粒细胞的发生作用表型,以了解其对细胞形态和功能的影响。此外,我们还将探究三七对中性粒细胞的特异性作用,揭示其针对炎症反应的机制。同时,我们将进一步研究三七产生抗炎作用的分子机制或通路,揭示其对炎症信号传导和调控的影响。最后,我们将通过测试不同浓度的三七,确定其在抗炎疗效方面的最佳治疗浓度,以期在临床上开发新的中药三七治疗场景。通过本研究,我们将进一步了解三七的药理作用,为其临床应用提供科学依据。同时,对三七的深入研究有助于扩大中药的应用领域,并为中医药的现代化发展做出贡献。中性粒细胞在人体内占据最丰富的粒细胞类型,约占50%-70%。它们是宿主防御多种传染性病原体(包括病毒、细菌、真菌和原生动物)的首要防线。中性粒细胞的主要功能是吞噬病原体并促进受损组织修复。然而,如果中性粒细胞失调,其参与的浸润和炎症反应机制可能对宿主造成危害。过度激活和不受控制的中性粒细胞浸润可导致炎症和自身免疫性疾病,如急性肺部炎症/损伤、缺血/再灌注损伤、类风湿性关节炎和脓毒症等。新型冠状病毒性肺炎近年来就是由于炎症失控导致肺部炎症渗出和肺实变,最终导致患者呼吸衰竭和死亡。中性粒细胞凋亡是机体平衡的一部分,在老化的中性粒细胞中会被触发,但在特定情况下也可能被诱导。例如,使用血清或抗体刺激病原体吞噬和细胞内杀伤作用会引发一种特定的细胞分化程序,最终导致吞噬作用诱导的细胞死亡(PICD)。由于中性粒细胞凋亡具有抗炎特性,这种机制似乎在感染被清除后促进组织修复方面非常适用。目前,针对这类疾病的治疗通常采用非甾体抗炎药和抗细胞因子疗法。然而,这些疗法在一定程度上会对先天性和适应性免疫系统造成损害,一旦失衡,就可能导致炎症扩散甚至无法控制。因此,需要开发新的治疗策略来清除过量的炎性中性粒细胞。斑马鱼是一种小型硬骨鱼,在过去三十年中逐渐成为炎症研究的关注对象。斑马鱼与人类具有高度的遗传相似性,其基因中超过87%与人类相似。斑马鱼拥有心脏、肝脏、胰腺、肠道等器官,其免疫系统在功能上与人类相似,并具备多个保守的炎症信号通路和免疫细胞类型。这使得斑马鱼成为研究炎症机制的简化模型生物体的理想选择。斑马鱼的造血系统与其他脊椎动物相似,包含多个细胞分化阶段。斑马鱼的胚胎和幼体具有光学透明性,这使得可以进行非侵入性成像研究炎症反应的动态过程。这种特性使得我们能够实时观察炎症的发展和进展。此外,斑马鱼具有快速繁殖的特点,能够产生大量后代,从而使得进行高通量筛选来评估潜在的抗炎化合物或基因修饰成为可能。这有助于确定潜在的药物靶点或指导新疗法的开发。因此,斑马鱼是评估先天免疫反应的宝贵工具,其独特的特征使其成为比啮齿动物模型更优越的选择。在动物研究中,已经有多篇报道关于PNS在缓解炎症方面的作用。然而,PNS中发挥抗炎效果的具体有效分子仍然不清楚,更重要的是,PNS发挥抗炎效果的相关机制也尚未明确,需要进一步的研究。本课题旨在通过对三七特异性诱导斑马鱼中性粒细胞凋亡表型机制的探索,开展与中药物质基础及作用相关的研究方向。我们将结合学科交叉和现代科学技术,全面挖掘三七的抗炎特性的具体分子机制。材料与方法:1.药物处理及动物模型。将受精后72小时(72 hpf)的可标记中性粒细胞的Tg(lyz:Ds Red2)斑马鱼幼鱼分别暴露在0mg/L,5mg/L,10mg/L和15 mg/L的PNS中,6小时后在荧光显微镜下进行观察成像,主要观察中性粒细胞受PNS影响的表型情况。2.PNS对中性粒细胞特异性评价研究。通过使用标记巨噬细胞,胸腺T细胞,造血干细胞的转基因鱼系,评价PNS对除中性粒细胞之外的其他髓系细胞的影响。3.PNS诱导中性粒细胞死亡方式的探究。使用巨噬细胞和中性粒细胞共同标记的转基因鱼系观察单细胞分辨率下PNS诱导中性粒细胞死亡过程。使用细胞自噬,细胞坏死性凋亡等多种细胞死亡抑制剂,观察是否影响PNS诱导的中性粒细胞死亡过程。使用TUNEL染色及Caspase 3活性染色判断PNS诱导中性粒细胞是否通过细胞凋亡途径。4.小分子筛选PNS诱导中性粒细胞凋亡的信号通路探索。使用RNA-seq检测PNS诱导变化的转录组,并分析具有显著变化的基因及信号通路。通过显著变化基因富集的信号通路结合与中性粒细胞凋亡有关的文献调研,使用大量小分子药物对PNS诱导中性粒细胞凋亡的过程进行干预,欲寻找可调控该过程的小分子药物及对应分子信号。5.PNS诱导中性粒细胞凋亡的分子机制研究。使用抗体显色对MAPK13时空表达情况进行探索,并结合蛋白质免疫印迹对MAPK13的蛋白表达水平进行分析。最后使用针对MAPK13下游蛋白的小分子药物进行干预,验证是否符合MAPK13所调控的信号通路。6.诱导炎性中性粒细胞凋亡产生最佳抗炎作用的PNS治疗浓度的探索。通过斑马鱼切尾炎症模型中发现PNS能够在低浓度下诱导炎症中性粒细胞向炎症部位趋化迁移和促进凋亡的表型,并通过LPS进一步探索PNS特异性诱导中性粒细胞凋亡的可能应用前景。结果:1.中性粒细胞死亡的速度随PNS的浓度增高而加快,PNS浓度越高,中性粒细胞死亡越快。2.PNS只对中性粒细胞有特异性作用,而对其他髓系细胞,如对巨噬细胞、胸腺T细胞和造血干细胞的数量、形态无明显影响。3.PNS诱导中性粒细胞内源性死亡后伴有巨噬细胞吞噬作用,且PNS诱导的中性粒细胞死亡不能被细胞自噬及细胞坏死抑制剂所阻止。TUNEL和Caspase 3活性活体染色在PNS诱导中性粒细胞过程中呈阳性。4.PNS使MAPK13(p38δ)特异性在中性粒细胞中表达。并且使用MAPK13下游的PKD1和PTEN蛋白的小分子抑制剂也可以干扰PNS诱导中性粒细胞凋亡的过程。5.低浓度PNS能够特异性促进斑马鱼切尾炎症模型中中性粒细胞向炎症尾部趋化迁移和尾部炎症部位被激活的炎性中性粒细胞的凋亡,而对正常中性粒细胞不发生效应。结论:1.PNS可以特异性诱导中性粒细胞发生死亡;2.死亡方式为凋亡;3.PNS处理可以特异性诱导中性粒细胞内p3Dehydrogenase抑制剂8δ蛋白表达上调并激活,然后通过调控其下游PKD1和PTEN的活化与功能的信号通路来参与中性粒细胞凋亡;4.低浓度PNS(5mg/L)可以快速并特异性诱导中性粒细胞向炎症部位趋化迁移和诱导被激活(炎性)中性粒细胞发生凋亡,PNS为5mg/L浓度是能发挥最佳抗炎作用。