第一部分云南健康哈尼族、壮族儿童TPMT及NUDT15基因多态性研究【目的】急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤,化学药物治疗仍然是其最常用的治疗方法。6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine,6-MP)是维持化疗的关键药物之一,但是治疗过程中严重的药物不良反应限制其使用,致命性的骨髓抑制导致严重感染,威胁患儿生命。硫嘌呤甲基转移酶(thiopurine metSTM2457化学结构hyltransferase,TPMT)和二磷酸核苷连接单元X型基序15(nucleoside diphosphate-linked moiety X-type motif 15,NUDT15)是巯嘌呤代谢相关基因,其基因多态性与6-MP不良反应密切相关。TPMT和NUDT15基因多态性分布具有明显的种族/地域差异。云南省是中国少数民族种类最多的省份,目前尚没有云南地区健康少数民族儿童TPMT和NUDT15基因多态性研究的较完整报道。基于此,本部分的研究拟选择2个人口数超过100万的少数民族(哈尼族和壮族)探索其健康儿童TPMT和NUDT15基因多态性分布,并与云南地区白族、傣族、彝族健康儿童及其他种族/地域的资料对比,初步分析影响这两个基因多态性分布的规律。【方法】选择云南地区三代以内均是哈尼族或者壮族且没有民族间通婚并且来自不同家庭的健康儿童,收集人口学资料,采集每例儿童3ml外周血放置-80°冰箱保存备用。通过外周血DNA提取、PCR扩增、基因测序等实验技术,分别对健Laboratory Services康哈尼族和壮族儿童外周血TPMT基因和NUDT15基因进行测序。测序的原始资料采用Snap Gene软件进行分析,数据整理后利用Hardy-Weinberg平衡检验对样本代表性进行评估,以确保检验样本具有群体代表性。完整资料整理后用IBM SPSS Statistics 24软件进行统计学分析。【结果】1.共完成151例健康哈尼族和112例健康壮族儿童外周https://www.selleck.cn/products/Fulvestrant.html血TPMT基因和NUDT15基因测序。2.健康哈尼族儿童TPMT基因测序仅发现1种SNP(TPMT*3C,rs1142345),风险等位基因频率3.64%;NUDT15基因测序共发现3种SNP(rs746071566,rs186364861和rs116855232),rs746071566的风险等位基因频率6.29%,rs186364861的风险等位基因频率0.99%,rs116855232的风险等位基因频率9.60%。3.健康壮族儿童TPMT基因测序仅发现1种SNP(TPMT*3C,rs1142345),风险等位基因频率1.34%;NUDT15基因测序共发现3种SNP(rs746071566,rs186364861和rs116855232),rs746071566的风险等位基因频率2.68%,rs186364861的风险等位基因频率1.34%,rs116855232的风险等位基因频率7.14%。4.TPMT*3C(rs1142345)在云南少数民族、中国汉族和其他少数民族、亚洲国家和地区整体分布频率均较低,组间无显著性差异;在非洲、欧洲、拉丁美洲整体分布频率均较高,接近云南少数民族频率的2倍,亚洲整体频率的3倍。5.NUDT15基因多态性在云南哈尼族、壮族、彝族、白族、傣族的分布,彝族风险等位基因频率最高的是rs746071566,其次是rs116855232;其他四个少数民族风险等位基因频率最高的是rs116855232,其次是rs746071566;风险等位基因频率最低的是rs186364861;NUDT15 rs116855232分布频率显著高于TPMT*3C(rs1142345)。6.NUDT15基因多态性rs746071566在云南地区少数民族分布显著高于中国维吾尔族和中国柯尔克孜族。rs116855232的风险等位基因频率在云南地区少数民族、中国维吾尔族、中国柯尔克孜族、中国汉族都较高;rs186364861的风险等位基因频率都较低,组间无显著性差异。7.NUDT15基因多态性rs746071566,rs186364861和rs116855232在云南地区少数民族、中国汉族、亚洲地区的风险等位基因频率显著高于非洲和欧洲地区,两组相差数十倍。【结论】1.云南地区健康哈尼族、壮族儿童TPMT基因和NUDT15基因测序未发现新的SNP,其分布规律与云南白族、傣族,中国汉族、亚洲地区整体一致,与非洲和欧洲地区分布不同,且NUDT15 rs116855232分布频率显著高于TPMT*3C(rs1142345)。2.云南地区的NUDT15基因多态性在彝族分布最高的是rs746071566,在哈尼族、壮族、白族、傣族中分布最高的是rs116855232,是云南地区所独有的分布特点。第二部分ALL患儿NUDT15及TPMT基因多态性分布及其与6-MP不耐受关系的研究【目的】恶性肿瘤是导致儿童死亡的第二大因素,白血病在儿童恶性肿瘤中排名首位,以急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)为主,严重威胁儿童的健康和生命。6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine,6-MP)是ALL化疗的基石,本研究第一部分已探讨了云南地区少数民族健康儿童巯嘌呤代谢相关基因NUDT15及TPMT基因多态性分布,但其在云南地区ALL患儿中的分布情况尚未见较完整的报道。基于此,本部分的研究拟选择云南地区ALL患儿探索其NUDT15及TPMT基因多态性分布,与健康儿童、不同疾病患儿、不同种族/地域分布的异同对比分析;寻找云南地区预测ALL患儿发生6-MP不良反应的基因多态性,明确其预测价值、对6-MP耐受剂量及预后的影响,并探讨民族差异是否影响其异同。【方法】选择云南地区急性淋巴细胞白血病患儿,收集人口学资料,采集每例患儿3ml外周血标本置-80°冰箱保存备用。通过外周血DNA提取、PCR扩增、基因测序等实验技术,分别对患儿外周血NUDT15基因和TPMT基因进行测序,测序的原始资料采用Snap Gene软件进行分析。准确记录随访的ALL患儿临床资料,包括临床基线资料、维持化疗期间6-MP药物不良反应、6-MP耐受剂量及预后等,完整资料整理后利用IBM SPSS Statistics 24软件进行统计学分析,Graph Pad Prism 7.0软件绘制图表。【结果】1.共完成了150例ALL患儿外周血NUDT15基因和TPMT基因测序。2.ALL患儿NUDT15基因测序共发现3种SNP(rs746071566,rs186364861和rs116855232),rs746071566风险等位基因频率5.67%;rs186364861风险等位基因频率2.33%;rs116855232风险等位基因频率10.33%。3.ALL患儿TPMT基因测序共发现2种SNP(TPMT*3C,rs1142345和TPMT*3A,rs1142345联合rs1800460),TPMT*3C风险等位基因频率1%;TPMT*3A风险等位基因频率0.33%,考虑TPMT*3A为罕见变异型。4.NUDT15的SNP风险等位基因频率最高的是rs116855232、其次是rs746071566、最低的是rs186364861;rs116855232的风险等位基因频率显著高于TPMT*3C(rs1142345)(10.33%VS 1%),差异有统计学意义。5.NUDT15基因多态性在云南地区ALL患儿、云南地区少数民族健康儿童和中国汉族健康儿童、中国汉族和中国台湾地区、日本、新加坡、韩国的ALL或者IBD患儿中分布无显著性差异。6.NUDT15基因是预测云南地区ALL患儿发生6-MP药物相关的骨髓抑制的较好指标,NUDT15基因突变后6-MP耐受剂量显著下降,但是在汉族和少数民族间无显著性差异。7.NUDT15基因SNP,rs746071566和rs116855232均是预测云南地区ALL患儿发生6-MP药物相关的骨髓抑制的较好指标,发生突变后6-MP耐受剂量显著下降,并且在汉族和少数民族间无显著性差异。8.3例发生TPMT基因突变的云南地区ALL患儿均未发生6-MP相关的药物不良反应。9.云南地区ALL患儿的远期预后,无事件生存率在伴有或者不伴有NUDT15基因突变的患儿之间无显著性差异。【结论】1.云南地区ALL患儿NUDT15基因测序和TPMT基因测序未发现新的SNP,其基因多态性分布规律与中国其他民族、亚洲国家/地区的健康儿童、ALL患儿或者IBD患儿间无显著性差异,且NUDT15基因多态性分布明显高于TPMT基因。2.云南地区ALL患儿NUDT15基因多态性,尤其是SNP rs746071566和rs116855232均是预测6-MP药物相关的骨髓抑制的较好指标,其显著降低6-MP耐受剂量,但是在汉族和少数民族间无显著性差异,并且与患儿远期预后无关。第三部分6-MP对ALL细胞作用与能量代谢变化及NUDT15沉默对其影响【目的】6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine,6-MP)是干扰RNA、DNA合成的嘌呤类抗代谢药物,具有显著的抗增殖作用。6-MP作为儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)化疗的基石,抑制肿瘤细胞的增殖、维持疾病长期缓解,但是其确切分子机制尚不完全清楚。代谢重编程是肿瘤细胞的十大特征之一,处于肿瘤发生发展的核心地位。6-MP作为典型的嘌呤类抗代谢药物,与代谢重编程关系密切,但是6-MP对ALL细胞作用与能量代谢变化的研究较少。本研究第二部分已经明确了NUDT15基因多态性增加ALL患儿化疗过程中6-MP细胞毒性、减少6-MP耐受剂量,但是其是否干扰能量代谢影响6-MP对ALL细胞的分子作用机制尚未见报道。基于此,本部分的研究将探讨6-MP抑制ALL细胞存活的分子机制,尤其是细胞自噬的作用,并从能量代谢的角度分析能量代谢与细胞自噬的关系;同时,对NUDT15基因沉默影响6-MP细胞毒性作用的分子机制,从能量代谢的角度进行初步探讨。【方法】选择急性T淋巴细胞白血病细胞株JURKAT和急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM6作为研究的目标细胞株,筛选合适的6-MP药物浓度及作用时间,检测6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞的凋亡、细胞周期阻滞及细胞自噬作用。通过6-MP干扰JURKAT细胞和NALM6细胞代谢检查点的表达以及ATP生成量,了解6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞能量代谢影响、与细胞自噬的关系。通过设计质粒、重组慢病毒感染构建NUDT15基因沉默的JURKAT~(shNUDT15)细胞株和NALM6~(shNUDT15)细胞株,评估NUDT15基因沉默对6-MP细胞毒性的影响。通过6-MP对JURKAT~(shNUDT15)细胞株和NALM6~(shNUDT15)细胞株自噬和代谢检查点表达的影响,从能量代谢角度初步了解NUDT15基因沉默对6-MP引起细胞自噬的作用:(1)筛选JURKAT细胞和NALM6细胞合适的6-MP药物浓度及作用时间:Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞存活率,绘制细胞存活率曲线,计算IC_(50);(2)6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞的凋亡作用:流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率、Western Blot检测细胞凋亡标志蛋白;(3)6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞的周期阻滞作用:流式细胞术PI/RNase Staining Buffer检测细胞周期各阶段比例,Western Blot检测细胞周期标志蛋白;(4)6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞的自噬作用:免疫荧光染色检测细胞LC3的荧光强度,Western Blot检测自噬标志蛋白,以及利用自噬抑制剂(3MA)进行回补实验验证;(5)6-MP对JURKAT细胞和NALM6细胞能量代谢影响:Western Blot检测代谢检查点蛋白表达,ATP微量法试剂盒用酶标仪检测细胞ATP生成量;(6)重组慢病毒构建NUDT15沉默的JURKAT和NALM6细胞株:设计3条NUDT15沉默的序列插入质粒载体,通过Western Blot检测NUDT15蛋白以筛选最优的沉默序列,慢病毒包装、抽提、重组慢病毒感染构建JURKAT ~(shNUDT15)稳转细胞株和NALM6 ~(shNUDT15)稳转细胞株;(7)NUDT15基因沉默对6-MP细胞毒性的影响:Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞存活率,绘制细胞存活率曲线,评估6-MP细胞毒性;(8)NUDT15基因沉默对6-MP作用JURKAT和NALM6细胞自噬及代谢检查点影响:Western Blot检测自噬相关蛋白及代谢检查点表达。【结果】1.在选择的药物浓度下作用48小时,6-MP促进了JURKAT细胞凋亡、细胞周期阻滞和细胞自噬,并且细胞自噬表现为细胞的死亡方式,抑制了细胞存活;2.在选择的药物浓度下作用48小时,6-MP促进了NALM6细胞周期阻滞和细胞自噬,并且细胞自噬表现为细胞的死亡方式,抑制了细胞存活;3.在选择的药物浓度下作用48小时,6-MP抑制了JURKAT细胞和NALM6细胞ATP生成、干扰细胞代谢检查点蛋白表达;4.成功构建JURKAT ~(shNUDT15)稳转细胞株和NALM6 ~(shNUDT15)稳转细胞株,NUDT15基因沉默干扰细胞代谢检查点蛋白表达、促进细胞自噬、增加6-MP细胞毒性。【结论】1.6-MP通过促进细胞凋亡、细胞周期阻滞及细胞自噬抑制ALL细胞存活;同时,6-MP抑制ALL细胞ATP生成量,干扰代谢检查点P-AMPK和P-m TORC1表达,可能促进了细胞自噬。2.NUDT15基因沉默增加6-MP细胞毒性,可能与细胞自噬增加有关,并且伴有代谢检查点表达的改变。