畜禽炎性腹泻在养殖业中普遍存在,且危害严重。养殖过程中,以饲料端添加抗生素的方式在防治畜禽腹泻中起到重要作用,然而长期不合理的使用抗生素导致耐药菌株不断产生、食品安全遭受严重威胁。我国农业农村部要求从2020年1月1日起,禁止在饲料中添加除中药外的所有促生长类添加剂。五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharide,SCP)是中药五味子的有效成分之一,具有缓解肠损伤的潜在作用。但作为大分子物质,其生物利用度极低,限制了其临床应用。纳米硒作为一种新的硒形态,相比于传统硒,具有更高的生物利用度、更低的毒性、更强的生物活性等特点,受到了越来越多的关注。但是,裸露的纳米硒的稳定性差,极易聚集为无生物活性的灰色单质硒,限制了其生物活性的发挥。以多糖为模板修饰纳米硒在结合多确认细节糖和硒优势的同时,可提高硒的稳定性和多糖生物利用率。本研究通过水提醇沉法提取五味子粗多糖,经分离纯化后用于五味子多糖纳米硒(SCP-Selenium nanoparticles,SCP-Se NPs)的制备,并在体内探究SCP-Se NPs对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导小鼠肠道炎性损伤的保护作用,为SCP-Se NPs的临床应用提供理论依据。1.SCP的提取及分离纯化。本研究通过水提醇沉法提取五味子粗多糖;经Sevage法、DEAE-52纤维素柱层析法纯化五味子多糖;苯酚-硫酸法测定糖含量;Molish反应、斐林试剂反应和双缩脲试剂反应对SCP进行理化性质分析;柱前衍生化高效液相色谱法测定SCP单糖组成。结果显示:五味子粗多糖的提取率为2.9%;纯化后糖含量为89.2%;SCP属于糖类物质,无可溶性还原糖及蛋白质类物质;SCP由Man,Rib,Rha,Glc A,Gal A,Glc,Xyl,Ara组成。2.SCP-Se NPs的制备与表征。通过化学还原法制备SCP-Se NPs,利用双波长比色法探究在SCP-Se NPs制备过程中,SCP浓度对SCP-Se NPs稳定性的影响;TEM观察SCP-Se NPs表面形态;XRD分析SCP-Se NPs的晶体结构;EDX检测SCP-Se NPs的元素组成;FTIR检测SCP与Se NPs的结合方式;激光粒度仪检测不同储存环境下SCP-Se NPs在第0、3、7、14 d其粒径、PDI、Zeta电势的变化。结果表明,制备SCP-Se NPs的最佳SCP浓度为0.1 mg/m L;所制得的SCP-Se NPs粒径为120.8 nm,PDI为0.17,Zeta电势为-38.3 m V;呈均匀分散球型,为非晶体结构;主要由碳、硒、氧元素组成;SCP与Se NPs形成新的O-H···Se键和C-O···Se键。室温下的SCP-Se NPs在第7 d粒径、PDI均增大,第14 d可见沉淀,电势无改变;4℃保存的SCP-Se NPs粒径、PDI、电势在14 d内均无变化。3.探究SCP-Se NPs对LPS诱导小鼠肠道炎性损伤的保护作用。除空白组外,其余组腹腔注射LPS,观察6 h内小鼠的精神状态、被毛情况、粪便性状、腹泻情况;统计疾病活动指数(Disease activity index,DAI);HE染色观测肠道绒毛高度和隐窝深度的变化;AB/PAS染色观察小鼠肠道杯状细胞的情况;免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)观察紧密连接蛋白(Zonula occludens-1,ZO-1)的表达;ELISA检测血清中IL-1β,IL-6,TNF-α的含量;q RT-PCR检测肠道组织IL-1β,IL-6,TNF-α,NLRP3,TLR4,My D88,NF-κB的m RNA水平。结果表明:(1)临床症状观察发现,模型组小鼠精神沉郁,懒动,体温降低,喜扎堆,竖毛且被毛杂乱无光泽,腹泻,肛门周围被污染,粪便腥臭,潜血呈阳性;与模型组相比,SCP组和SCP-Se NPs组小鼠精神沉郁、腹泻、粪便隐血症状减轻。(2)DAI评分统计结fine-needle aspiration biopsy果发现,与空白组相比,模型组DAI评分显著升高(P<0.05);与模型组相比,SCP组DAI评分降低(P>0.05),SCP-Se NPs组DAI评分显著降低(P<0.05)。(3)组织病理学检查发现,与空白组相比,模型组小鼠空肠绒毛破坏严重,上皮细胞大量脱落,绒毛发生断裂、脱落和萎缩,绒毛高度显著降低(P<0.05),隐窝深度显著增加(P<0.05),绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低(P<0.05);与模型组相比,经SCP处理的小鼠空肠绒毛结构得到修复,绒毛高度与隐窝深度的比值升高(P<0.05),经SCP-Se NPs处理小肠绒毛结构完整,无大面积的绒毛脱落,且绒毛排列较整齐,其绒毛高度显著增加、隐窝深度显著降低(P<0.05),绒毛高度与隐窝深度的比值显著升高(P<0.05)。(4)杯状细胞数量统计发现,与空白组相比,模型组中杯状细胞减少甚至消失(P<0.05),粘液层厚度降低;与模型组相比,SCP组、SCP-Se NPs组中杯状细胞数量和粘液面积有不同幅度的增加(P<0.05)。(5)ZO-1表达可见,与空白组相比,模型组ZO-1表达水平降低(P<0.05);与模型组相比,SCP组ZO-1蛋白表达水平升高(P>0.05),SCP-Se NPs组ZO-1蛋白表达水平升高(P<0.05)。(6)检测血清中IL-1β,IL-6,TNF-α的含量发现,与空白组相比,模型组血清中IL-1β,IL-6,TNF-α的含量显著升高(P<0.05);与模型组相比,SCP组和SCP-Se NPs组血清中IL-1β,IL-6,TNF-α的含量显著降低(P<0.05)。(7)肠道组织IL-1β,IL-6,TNF-α,NLRP3,TLR4,My D88,NF-κB的m RNA水平。与空白组相比,模型组中肠道组织IL-1β(P<0.05),IL-6(P<0.05)和TNF-α(P<0.05),NLRP3(P<0.05),My D88(P>0.05)的m RNA相对表达量升高;与模型组相比,SCP组和SCP-Se NPs组肠道组织购买PUN30119IL-1β(P<0.05),IL-6(P<0.05),TNF-α(P<0.05),NLRP3(P<0.05),TLR4(P>0.05),My D88(P>0.05),NF-κB(P>0.05)的m RNA相对表达量降低,且SCP-Se NPs的作用好于SCP。综上所述,SCP水提醇沉的得率为2.9%,分离纯化后SCP的糖含量为89.2%。SCPSe NPs制备的最佳SCP浓度为0.1mg/m L,且所制得的SCP-Se NPs粒径为120.8 nm,PDI为0.17,Zeta电势为-38.3 m V,呈均匀分散球型的非晶体结构,主要由碳、硒、氧元素所组成。SCP与Se NPs之间依赖于O-H···Se键和C-O···Se键结合,且在4℃条件储存更稳定。在LPS诱导的小鼠肠道炎性损伤模型中,SCP与SCP-Se NPs均可改善小鼠的临床症状,缓解肠道组织病理损伤,阻止ZO-1的丢失,降低血清中IL-1β,IL-6和TNF-α的含量,降低组织炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-αm RNA水平,降低组织中NLRP3的m RNA水平,且SCP-Se NPs的治疗作用优于SCP。推测SCP-Se NPs可能通过抗炎、修复肠道屏障来改善小鼠肠道炎性损伤。