一、研究背景H9N2禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)于1994年首次传入我国广东省养殖场,并逐渐蔓延至全国各地,现已取代H5N6和H7N9成为禽类和环境中的优势亚型。同时,自1998年在我国香港首次发现人感染H9N2病例至今,全球范围已陆续报告散发病例超过160例,其中90%以上的人感染H9N2病例发生在中国,且近8年感染人数呈上升趋势。可见,对H9N2 AIV的预防控制不仅关乎养殖产业发展,也对公共卫生安全具有重要意义。另一方面,H9N2 AIV为高致病性禽流感病毒的动态进化提供了内部基因片段,丰富了病毒进化方向,扩宽了病毒传播范围,增加了跨物种感染风险。由于每年报告的人感染H9N2 AIV病例主体为有活禽市场活动轨迹的暴露人群,具备污染环境接触史,证实了环境污染在“禽-环境-人”流感传播链条中的关键地位,也提示环境污染控制在防止H9N2 AIV大范围传播,降低流感病毒的社会危害具有重要意义。本研究以H9N2 AIV为研究对象,深入剖析流感病毒在“禽-环境-人”传播进程中的遗传特征和传播特性演化规律,为流感病毒的监测预警提供方向指引,同时也为寻找切断流感病毒传播途径的方法提供新思路。二、研究目的H9N2 AIV在中国不同省份广泛流行并持续存在的原因,主要与动物传染源防控不及时、环境监测预警不充分、污染场所消杀不到位等因素有关。本研究将针对H9N2 AIV环境暴露人群,融合环境现场监测与临床特征分析,依托遗传进化分析与体内外评价模型,开展人感染H9N2 AIV环境暴露风险与传播能力演化规律研究。本研究结合遗传演化关系与传播力变化趋势两个视角,综合分析H9N2AIV在“禽-环境-人”传播链条中的演化规点击此处律,研判Hnatural biointerface9N2 AIV致病能力、传播方式、传播能力和环境耐受力的变化规律,从流行病学、生物信息学、病原生物学、环境生物学等角度研讨病毒预警控制策略,为H9N2疫情防控提供理论与技术参考。三、研究方法1.H9N2 AIV环境暴露风险监测与评估:通过文献调研和数据分析,开展1998-2022年全国H9N2 AIV人感染确诊病例时间、地域、年龄、性别、暴露史、临床症状等流行特征研究,结合2017-2021年厦门市职业暴露人群H9N2 AIV血清学数据以及活禽市场环境监测数据,综合分析评估H9N2流行趋势及其感染相关影响因素。通过筛选环境传播典型病例,梳理其流行病学背景,采集并初步分析临床和环境样本。2.“禽-环境-人”传播的时空分布追踪:对临床和环境样本进行流感病毒鸡胚分离培养,再经过流感病毒基因组扩增测序,获得4株流感病毒基因组序列。利用最大似然法和贝叶斯法构建遗传发育进化树,并估算病毒进化的速率和分歧时间,探究4株病毒的遗传演化关系与时空分布规律。通过对关键氨基酸位点突变进行分析以及时空分布的追踪研究,揭示4株H9N2病毒存在“禽-环境-人”的传播特性。3.H9N2 AIV跨种感染与致病性演化规律:通过受体特异性结合实验,解析4株流感病毒对不同类型唾液酸受体的亲和力,评估其跨种感染风险。利用MDCK和A549细胞掌握4株病毒体外增殖能力。构建BALB/c小鼠感染评价模型,解析4株病毒在小鼠体内不同器官的分布差异以及滴度变化,并结合小鼠肺组织病理观察、体重和存活变化,评估4株病毒在遗传进化过程中致病性和增殖能力的演化规律。4.H9N2 AIV环境稳定性和传播力演化规律:构建豚鼠传播评价模型,评估4株病毒在哺乳动物间的接触传播和空气传播能力,解析4株病毒在不断适应哺乳动物宿主的过程中传播效率的演化规律。在实验室条件下,评价4°C、25°C和37°C三种不同温度和玻璃、塑料两种材料对4株病毒稳定性的综合影响,解析4株病毒环境耐受力的演化规律。四、研究结果1.H9N2 AIV流行趋势逐年上升且主要集中在活禽市场:通过文献调研和数据分析,发现我国感染人数累计143例,占全球感染人数的90%以上。统计结果显示,H9N2人感染病例的流行特征明显,主要集中发生在我国南方城市有活禽接触史或活禽市场暴露史的人群中,临床表现主要为发热及上呼吸道感染症状。2017-2021年H9N2 AIV在厦门市各活禽市场环境中广泛存在,并在2020-2021年检测到2名活禽市场工作人员感染H9N2 AIV。通过流感监测筛选到1名职业暴露患者,对其临床样本、流调相关人员临床样本、环境采集样本进行核酸检测,结果显示患者临床样本及环境样本均为阳性,流调相关人员样本均为阴性,提示活禽市场受污染环境是职业暴露人员感染的主要原因。2.4株H9N2 AIVs具有遗传演化关联和与致病传播相关突变位点:从上述患者临床样本和与之工作相关的活禽市场环境样本中成功分离到1株人源(H19)和3株相关环境源H9N2 AIVs(E01、E02和E03)。通过测序分析,发现4株病毒具有极高的同源性,并具有明显遗传演化关系,HA基因与参考株A/chicken/Anhui/YHZS014-O/H9N2/2018亲缘性较近,NA基因与参考株A/chicken/Fujian/FZHX0030-C/H9N2/2018亲缘性较近。贝叶斯模型分析结果显示4株病毒具有明显时空分布规律,其中E03分歧于2019年夏季,其次是E02分歧于2020年春天,E01和H19分歧于2020年夏季。对关键氨基酸位点的突变进行分析,发现4株病毒均具有HA基因单碱性氨基酸裂解位点,符合低致病性禽流感病毒特征;均具有HA基因T~(163)N、Q~(234)L等偏好结合人α-2,6唾液酸受体的突变位点;均具有PA基因K~(356)R、PB2A~(588)V等提高病毒对哺乳动物致病性和增殖能力的突变位点;均具有HA基因K~(381)位点,提示4株病毒具有空气传播的可能性。3.4株H9N2 AIVs均具备对哺乳动物的感染和致病能力:通过受体结合特性实验,发现4株病毒均具有与人α-2,6唾液酸受体结合能力,具有跨物种感染人类的风险,其中H19结合能力最强。通过细胞增殖实验,发现4株病毒均具备在MDCK和A549细胞中的增殖能力,其中E03和H19分别在MDCK细胞和A549细胞中增值能力最强。在BALB/c小鼠感染评价模型中,4株病毒可以在小鼠体内除胰脏、肠道以外的多个器官中增殖,主要增殖部位是小鼠鼻甲、气管和肺等呼吸道器官。特别的是,可在小鼠脑中检测到E01和H19,提示病毒在适应哺乳动物宿主的过程中获得了突破血脑屏障的能力。通过小鼠肺组织病理观察,发现肺组织致病力从E03至E02呈现下降趋势,但E01至H19呈现显著回升。经过体重和存活率监测实验,E03和E02体重变化分别为最大和最小,感染后10天内E01与H19体重变化接近,但11至14天后H19逐渐恢复体重。4.4株H9N2 AIVs传播力和环境耐受力呈总体上升趋势:通过豚鼠传播评价模型,发现4株病毒均可通过接触方式在哺乳动物间传播,接触传播效率从E03至E02呈现下降趋势,但E01至H19呈现上升趋势,其中H19达100%接触传播效率。E03和E02无法通过空气传播,E01和H19的空气传播效率分别为33%和100%,4株病毒的空气传播效率呈总体上升趋势。并且,豚鼠血清抗体滴度与鼻洗液病毒滴度的检测结果一致。综合接触传播和空气传播实验结果,发现病毒在不断适应哺乳动物宿主的过程中,其总体传播效率呈上升趋势。通过环境耐受力实验,发现在塑料表面,在4°C条件下,4株病毒存活时间大于5天;在25°C条件下,E03、E02和H19存活时间小于5天,E01大于5天;在37°C条件下,4株病毒存活时间小于0.5天。在玻璃表面,在4°C条件下,4株病毒存活时间大于5天;在25°C条件下,E03和E02存活时间小于5天,E01和HMLN8237体内实验剂量19大于5天;在37°C条件下,4株病毒存活时间小于0.5天。综合分析结果,发现4株病毒的环境耐受力呈现总体上升趋势。五、研究结论人感染H9N2禽流感病例90%以上在中国,其主要传染源为活禽市场,感染原因主要为接触已感染活禽或暴露于病毒污染环境。通过流感病例监测,筛选到1例由环境暴露感染H9N2病例,进一步采集获得该病例相关的临床样本、该病例工作场所的8份H9阳性环境样本和同辖区另一活禽市场的13份H9阳性相关环境样本,进而通过细胞培养、鸡胚扩增和测序鉴定,最终成功分离到4株H9N2流感病毒。对4株病毒开展遗传进化分析,贝叶斯模型时空分布分析结果提示,3株环境源病毒和1株人源病毒在时间和空间上存在沿“禽-环境-人”的传播特征。进一步综合受体结合、体内外增殖、致病传播、环境耐受等病原学特征分析,揭示在遗传演化进程中,病毒在哺乳动物间的接触传播和空气传播能力呈上升趋势,增加了人感染H9N2 AIV的可能性,揭示了环境暴露是活禽市场中导致人感染H9N2 AIV的重要途径。本研究融合流行病学、生物信息学、病原生物学、环境生物学等交叉学科前沿技术,形成针对流感病毒环境传播模式的监测预警与风险评估方案,对解决AIVs循环传播问题提供了技术参考,同时为我国H9N2流感疫情的综合防控提供理论支撑。