研究背景和目的肝内胆管癌是起源于二级胆管及以上的胆管上皮细胞的恶性肿瘤,近年来,发病率和病死率不断攀升,尤其高发于中国、越南等亚洲国家。肝内胆管癌恶性程度高,早期诊断困难,且具有极强的侵袭和淋巴结转移特性。手术治疗是目前治愈胆管癌唯一可能的方法,但根治性手术后5年生存率仅有1 5%～40%。随着精准医学的理念逐渐深入,亟需从分子水平和肿瘤微环境方面认识和防治肝内胆管癌。在2019版WHO《消化系统肿瘤分类》中,根据组织学特征和细胞起源将肝内胆管癌分为大胆管型和小胆管型,取代了传统按照大体病理、分化程度INCB28060半抑制浓度或黏蛋白表型分型的方式。临床研究发现,大胆管型肝内胆管癌的患者淋巴转移比例更高、预后更差,但目前对这两种胆管癌分型在分子水平上的了解很少,尚无指南或研究指导两者的区别治疗。既往研究肝内胆管癌的难点在interstellar medium于临床样本少(发病率相对较低且部分患者诊断时已丧失手术机会)、缺乏合适的动物模型(暂无鼠源肝内胆管癌细胞系)以及对该肿瘤的认识停留在大体水平、对内部细胞异质性知之甚少。针对上述难点,我们依托海军军医大学东方肝胆外科医院的临床样本库资源和国家肝癌科学中心的实验平台,采用小鼠高压水动力尾静脉注射构建小鼠原位肝内胆管癌模型,利用单细胞转录组测序和空间转录组测序技术深入探究肝内胆管癌内部异质性和亚型特征,探索分子机制,并在体内外进行实验验证。综上,本研究拟从肝内胆管癌的两种分子分型(大胆管型和小胆管型)入手,探讨该肿瘤内部微环境特征、不同分型间差异和淋巴转移相关机制,解析肿瘤微环境对于患者总生存期的影响,为了解肝内胆管癌肿瘤特征、指导精准治疗提供理论和实验基础。研究方法1、收集肝内胆管癌患者的肿瘤和癌旁组织以及术中切除的淋巴结进行单细胞转录组测序,部分临床组织经冰冻切片后进行空间转录组测序。2、运用InferCNV算法鉴定上皮细胞良恶性,并用monocle伪时序算法,研究上皮细胞的分化轨迹。3、用已知肝内胆管癌亚型的标志物确认分组,用GSVA算法研究两者分子和通路特征差异,用SCENIC算法研究CD47表达高低不同肿瘤细胞的转录调控因子表达情况。4、利用缺氧小室进行缺氧培养,使用免疫组化和蛋白免疫印迹研究肝内胆管癌组织样本的CD47表达情况,以及转录因子HIF-1α对肿瘤细胞CD47的调控作用。5、通过比较特定细胞亚群在肿瘤和癌旁的分布比例,研究与肿瘤细胞丰度呈正相关的细胞亚群,利用CellChat算法研究细胞之间的受体-配体关系。6、用galectin-1重组蛋白处理肿瘤细胞,通过流式细胞术、CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭/迁移实验以及qPCR,研究LGALS1对肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移的作用和机制。7、使用siRNA干扰成纤维细胞HFF-1中LGALS1的表达,通过共培养体系研究对肿瘤细胞的增殖和迁移能力影响,用ELISA检测培养上清中细胞因子水平。8、使用流式细胞术、多色免疫荧光研究特定细胞群在肝内胆管癌临床样本和小鼠胆管癌造模样本中的存在和分布特征。9、使用GEO数据集研究特定细胞群表达水平高低与肝内胆管癌患者预后的关系。使用TISCH2和TCGA数据库研究LGALS1和SIRPA的泛肿瘤表达水平的异同。10、采用红血球吞噬实验和大肠杆菌吞噬实验来研究缺氧条件下巨噬细胞对细胞和病原体的吞噬功能改变。11、使用CCR5抑制剂Maraviroc研究CCL5/CCR5轴对巨噬细胞的趋化作用。12、用裸鼠皮下荷瘤实验研究LGALS1、CD47和SIRPα对肿瘤增殖的影响,用组化染色和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡以及各种细胞组分的数量变化。13、使用基于XGOF的知识引导算法推理ICC微环境关键细胞亚群和信号通路,围绕缺氧通路和巨噬细胞开展相关分析验证。14、通过空间转录组技术研究SIRPα+巨噬细胞和淋巴内皮细胞的共定位关系。15、通过淋巴细胞成管实验研究巨噬细胞和肝内胆管癌细胞的促淋巴管新生作用。研究结果1、不同患者来源的样本中各细胞群分布呈现高度异质性,T细胞、NK细胞和树突状细胞在肿瘤组织中的浸润减少,单核/巨噬细胞和成纤维细胞在肿瘤组织浸润增多。2、鉴定出拷贝数变异较高的恶性细胞,以高表达ALB的正常上皮细胞为起点,分成两条分化轨迹。3、大胆管型胆管癌高表达基因CD47、MMP7、MUC1、TFF1和CDH1,CD47high肿瘤细胞受到转录因子HIF-1 α调控。通路水平上小胆管型胆管癌上调WNT-CATENIN通路,而大胆管型则上调KRAS通路,此外还上调糖酵解和缺氧通路,大胆管型的表型与胰腺导管癌接近,而小胆管型与原发性肝癌更为接近。4、大胆管型肝内胆管癌内部呈现更加缺氧的状态,并通过HIF-1α调控肿瘤细胞上调CD47的表达。5、LGALS1+成纤维细胞在肝内胆管癌肿瘤组织中分布比例较高,该群细胞LGALS1的转录水平与肿瘤细胞丰度呈显著正相关。6、LGALS1可抑制肿瘤细胞凋亡、增加S期细胞并减少降低G2/M期细胞比例,并通过上调CCR2、ADAM15和β-整合素促进肿瘤侵袭和迁移。7、高表达LGALS1的成纤维细胞通过分泌细胞因子MMP11、MCP-1和IL-6促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。8、SIRPα+巨噬细胞在ICC肿瘤组织内部和ICC患者外周血中高表达。9、LGALS1+成纤维细胞和SIRPα+巨噬细胞浸润严重的患者预后较差,并与肿瘤分期有显著相关性。10、缺氧环境抑制巨噬细胞对病原体和细胞的非特异性吞噬功能。11、肿瘤细胞通过CCL5/CCR5介导SIRPα+巨噬细胞的募集,从而促进肿瘤进展。12、小鼠皮下荷瘤模型中抑制LGALS1、CD47和SIRPα表达可以抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡。13、肝内胆管癌XGOF的通路与细胞亚群预测发现,缺氧通路、效应T细胞、激活型巨噬细胞与肝内胆管癌显著关联,XGOF中“免疫反应”相关本体分析发现,巨噬细胞迁移这一生物学过程在胆管癌中显著富集。14、空间转录组揭示SIRPα+巨噬细胞和淋巴内皮细胞的共定位关系。15、SIRPα+巨噬细胞可以促进淋巴内皮细胞成管。结论肝内胆管癌是一种高度异质性的恶性肿瘤,为了研究肝内胆管癌的肿瘤内异质性,我们分析了初治患者原发肿瘤、邻近正常组织和淋巴结的单细胞转录组和空间转录组测序数据,发现大胆管型肝内胆管癌组织内部更加缺氧,肿瘤细胞表面高表达CD47,通过CCR5/CCL5招募SIRPα+巨噬细胞介导免疫抑制作用。本研究还通过空间转录组技术揭示SIRPα+巨噬细胞和淋巴内皮细胞的共定位关系,缺氧培养后的肿瘤细胞和巨噬细胞培养上清可以显著促进淋巴管生成,推测这可能是大胆管型肝内胆管癌淋巴转移比例较高,且预后较差的原因。肿瘤微环境方面,一群以LGALS1为标志物的成纤维细胞亚群在肿瘤中比例增高且上调缺氧相关通路基因,LGALS1基因编码的分泌蛋白galectin-1调节细胞周期并促CL13900半抑制浓度进肿瘤进展和转移,导致预后较差。体内外抑制LGALS1、CD47和SIRPα在相应细胞上的表达可以抑制肿瘤增殖、促进细胞凋亡。我们的工作将进一步加深对肝内胆管癌微环境和组织异质性的了解,并通过靶向肿瘤微环境中的成分为肝内胆管癌的治疗提供新的策略。