双孢蘑菇是世界范围内栽培规模最大及生产量最大的一种食药用菌。已有大量研究证实,多糖是双孢蘑菇主要的功能活性成分之一,具有显著的健康功效,如免疫调节活性、抗氧化活性、抗肿瘤作用、降血糖作用及肝保护作用等。通常,食用菌多糖的免疫调节活性与其结构特征密切相关。然而,关于双孢蘑菇多糖的结构特征与其免疫活性之间的潜在构效关系尚不完全清楚,极大限制双孢蘑菇多糖在功能性食品和医药领域的应用,值得进一步探讨。因此,为揭示双孢蘑菇免疫调节活性多糖的结构特征及其潜在免疫活性构效关系,促进双孢蘑菇多糖在相关领域的应用。本研究首先优化了双孢蘑菇多糖的提取条件;随后,建立双孢蘑菇多糖的快速分离技术,并对其理化性质进行分析;最后,采用体内外模型评价双孢蘑菇多糖的免疫调节活性,以探讨双孢蘑菇多糖潜在免疫活性构效关系。本研究主要结果如下:1.双孢蘑菇多糖的提取条件优化采用单因素和响应面实验优化热水提取双孢蘑菇多糖的提取条件。首先,通过单因素实验确定影响双孢蘑菇多糖提取率主要因素的最优水平。随后,根据单因素实验结果,进行响应面实验设计优化,并充分考虑实际操作条件,得到热水提取双孢蘑菇多糖的最佳提取条件为:液料比30 m L/g,提取温度86℃,提取时间117 min。在此最佳提取条件下,双孢蘑菇多糖的实际提取率为4.96%±0.08%,非常接近模型预测值5.02%。2.双孢蘑菇多糖的快速分离和理化性质分析采用分级醇沉联合膜分离技术分离得到两个双孢蘑菇多糖均一组分,并对其理化性质进行分析。研究结果表明,当采用乙醇终浓度为38%(v/v)时可获得均一组分1(ABP-1),当乙醇终浓度为68%(v/v)并结合分子截留量为100 k Da的超滤膜可获得均一组分2(ABP-2),实现双孢蘑菇粗多糖(ABP)中两个多糖组分的有效分离。ABP-1的得率为3.67%,高于ABP-2(0.211%),表明ABP-1是ABP的主要成分。ABP-1和ABP-2的总多糖含量分别为91.32%和88.16%,显著高于ABP(77.99%)。此外,ABP-1和ABP-2的分子量分别为8.95×10~6 Da和1.73×10~4 Da,与ABP中的组分1和组分2对应。这些结果表明,分级醇沉联合膜分离技术可有效分离双孢蘑菇粗多糖。随后,进一步通过单糖组成、红外光谱和核磁共振光谱分析ABP及其分离均一组分(ABP-1和ABP-2)的结构特征。结果表明,ABP主要含有α-(1→4)-D-Glcp、α-(1→6)-D-Glcp、β-(1→6)-D-Glcp、β-(1→4)-D-Glcp和α-(1→6)-D-Galp等糖残基。ABP-1是一种α-(1→4)-D-葡聚糖,主要含有α-(1→4)-D-Glcp和α-(1→6)-D-Glcp等糖残基。ABP-2是一种葡半MK-1775使用方法乳聚糖,主要含有α-(1→6)-D-Glcp、β-(1→4)-D-Glcp、β-(1→6)-D-Glcp和α-(1→6)-D-Galp等糖残基。结果表明,从双孢蘑菇粗多糖中分离得到的ABP-1和ABP-2的结构特征存在明显差异。3.双孢蘑菇多糖的体内外免疫调节活性评价首先,采用RAW 264.7巨噬细胞模型评价ABP及其分离均一组分(ABP-1和ABP-2)的体外免疫调节作用。随后,进一步采用环磷酰胺(CTX)诱导的免疫低下小鼠模型,评价ABP及其分离均一组分体内免疫调节作用。研究结果表明,ABP及其分离均一组分均具有良好的体内外免疫增强活性。细胞实验表明,ABP及其分离均一组分在所有测试浓度下均对RAW 264.7巨噬细胞没有毒性且可刺激其释放免疫分子,但ABP-1和ABP-2在体外显示出比ABP更强的免疫增强活性,即促进一氧化氮(NO)、白细胞介素6(IL-6)和抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放,且ABP-Epigenetics抑制剂2效果最佳。动物实验表明,ABP及其分离均一组分对CTX引起小鼠的免疫器官损伤具有保护作用,均可增加脾脏和胸腺指数,而ABP-2增强效果最佳,且ABP-2对胸腺指数增加有显著效果。同时,ABP及其分离均一组分也能有效改善脾脏组织病理变化。此外,ABP及其分离均一组分能改善CTX诱导的小鼠血清中NO、IL-6和TNF-α含量的降低,但ABP处理的效果显著低于ABP-1和ABP-2,且ABP-1和ABP-Infectivity in incubation period2处理的效果差异无统计学意义。体内外研究结果均表明,与ABP相比,ABP-1和ABP-2具有更强的免疫增强活性,且ABP-2的免疫增强活性稍高于ABP-1,但无显著统计学差异。ABP-1和ABP-2的免疫增强活性显著高于ABP,这可能是由于分离后多糖的纯度提高和分子量降低。而ABP-1和ABP-2之间的这种活性差异可能是由于二者结构特征的不同,即单糖组成、分支度和糖苷键。具体表现为:ABP-1是一种α-(1→4)-D-葡聚糖,主要由葡萄糖组成且具有线性的α-(1→4)-Glcp骨架以及较低的分支度;ABP-2是一种葡半乳聚糖,由摩尔比约为1:1的葡萄糖和半乳糖组成且具有低分子量。研究结果表明,尽管ABP-1和ABP-2结构差异明显,但均具有显著的免疫增强活性。此外,ABP-1为ABP的主要组分,推测ABP-1为双孢蘑菇多糖免疫调节活性的主要贡献成分。研究结果有利于了解双孢蘑菇多糖的潜在免疫活性构效关系,为基于双孢蘑菇多糖的免疫增强功能性食品和药品开发提供科学理论依据和技术支撑。