双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种有机合成化合物,作为工业原料用于制备含聚碳酸酯和环氧树脂的产品。随着塑料制品的大量使用,BPA在环境中广泛存在,并对生物体的健康造成极大的威胁。BPA可经食物链进入人体和动物体内,会造成多组织损伤,出现炎症、细胞凋亡及坏死等多种损伤。硒作为一种机体必需的微量元素,在机体多种生理功能中发挥重要作用。缺硒可造成多种组织发生炎症反应,而NF-κB信号通路是重要的炎症反应调控通路之一,在多种疾病的发生与发展中参与调控。越来越多的研究表明,缺硒可能导致机体多种器官和组织损伤,气管也作为缺硒的靶器官之一。Mi RNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,通过调节多种基因的表达从而参与并调控许多生物学过程,并且mi RNA与炎症之间存在密切联系。然而BPA暴露和缺硒损伤鸡气管组织的具体分子机制,及mi RNA在其中发挥的作用尚不清晰。因此,本研究深入探究BPA暴露和缺硒造成肉鸡气管损伤的机制以及mi RNA在其中发挥的作用,以期明确BPA的毒性及肉鸡缺硒性疾病发生的分子机制。本研究首先复制了体内外BPA暴露或/和缺硒鸡模型,体内试验分为四组,对照组(Control组)、BPA暴露组(BPA组)、缺硒组(-Se组)、缺硒+BPA暴露组(-Se+BPA组)。采用H&E染色、PAS染色、超微结构观察分析肉鸡气管组织病理学和形态学的改变,通过差异表达筛选出肉鸡气管组织中变化显著的mi RNA,即mi R-155。体外试验分组为两部分,第一部分为体内试验相同分组,第二部分的具体分组为对照组(Control组)、缺硒+BPA暴露组(-Se+BPA组)、缺硒+BPA暴露组+mi R-155 inhibitor组(-Se+BPA+I组)、缺硒+BPA暴露组+NAC组(-Se+BPA+NAC组selleckchem)。通过生物信息学网站、双荧光素酶报告基因、q RT-PCR等方法预测并验证mi R-155的特异性靶基因。在肉鸡气管组织,经mi RNA-155 inhibitor转染或加入NAC的气管上皮细胞中,利用q RT-PCR、Western Blot、ELISA和免疫荧光染色等技术检测了抗氧化基因的变化、ROS水平、炎症信号通路及细胞因子、免疫功能相关的β-防御素、热休克蛋白和免疫球蛋白表达的变化。主要研究结果如下:(1)病理组织学观察结果显示,BPA暴露和缺硒引起鸡气管黏膜上皮出现纤毛缺失、脱落和黏液分泌,气道上皮杯状细胞增加,并伴有不同程度的炎性细胞浸润。-Se+BPA组病理改变最严重,上皮细胞排列紊乱,纤毛严重缺失脱落,气道上皮杯状细胞显著增加,并出现大量炎性细胞浸润和黏液分泌。超微结构观察结果显示,-Se组和BPA组气管上皮细胞部分出现细胞核染色质浓缩,部分线粒体空泡化,而-Se+BPA组出现细胞核染色质浓缩,线粒体大量空泡化,表明BPA暴露和缺硒能引起鸡气管组织炎性损伤。(2)BPA暴露和缺硒会引起鸡气管组织抗氧化酶CAT、SOD和GPX酶活性、及GSH含量不同程度寻找更多地下降,而MDA含量上升,-Se+BPA组气管中抗氧化酶活性进一步受到抑制,MDA含量显著升高。表明BPA暴露和缺硒联合发生可进一步加重诱导鸡气管氧化应激。(3)BPA暴露和缺硒能激活NF-κB信号通路,促炎细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、COX-2、i NOS、TNF-α和IFN-γ的表达水平显著升高,抗炎细胞因子IL-10表达的下降,热休克蛋白(HSP60、HSP70、HSP90)的表达上升,β-防御素(Av BD6、Av BD7、Av BD8、Av BD9、Av BD10)与免疫球蛋白(Ig A、Ig Y、Ig M)的水平下降,-Se+BPA组的表达水平变化更显著,表明BPA暴露和缺硒诱导鸡气管发生炎症和免疫损伤,BPA暴露和缺硒联合发生时,肉鸡气管炎症和免疫损伤更加严重。(4)筛选得到mi R-155为BPA暴露和缺硒Medial discoid meniscus的特异性mi RNA之一。在肉鸡气管组织中,mi R-155的m RNA表达水平显著升高。通过Targetscan、mi RDB等网站预测得到其潜在靶基因TRAF3,在体外培养气管上皮细胞的基础上,成功构建了mi R-155的干扰模型,使用双荧光素酶报告基因、q RT-PCR和Western Blot验证了mi R-155与TRAF3之间存在靶向关系。(5)在体外建立BPA暴露和缺硒模型,-Se+BPA组中ROS水平显著升高,过表达mi R-155显著增加了ROS的产生,加入NAC显著阻断ROS生成,沉默TRAF3可减少mi R-155过表达诱导的ROS生成。上述结果表明,过表达mi R-155和沉默TRAF3可逆转ROS的产生,mi R-155/TRAF3轴刺激ROS积累引发氧化应激。此外,转染mi R-155 inhibitor或经NAC处理后,NF-κB信号通路的表达显著下调,细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、COX-2、i NOS、TNF-α和IFN-γ水平显著降低,而IL-10水平明显上升,热休克蛋白(HSP60、HSP70、HSP90)的表达水平也下调,这说明mi R-155通过靶向TRAF3刺激ROS积累而诱导气管上皮细胞炎性反应和免疫损伤。综上所述,BPA暴露和缺硒导致肉鸡气管组织中mi R-155的表达显著升高,通过靶向抑制TRAF3,升高ROS的水平,激活NF-κB信号通路介导气管炎症的发生,最终导致肉鸡气管组织炎症和免疫损伤。本研究结果既丰富了BPA和缺硒对家禽气管损伤的研究内容,为防治BPA暴露和缺硒禽类炎症损伤提供新的理论依据。