研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉发生粥样硬化引起管壁狭窄或闭塞,导致心肌缺氧或坏死而引起的心脏病,简称冠心病(coronaty heart disease,CHD)。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是CHD的病理基础。AS是一种与脂质代谢障碍有关的全身性疾病,其病变特点是血液中的脂质进入到动脉壁并沉积于内膜形成粥样斑块,进而引起动脉狭窄性疾病。AS的发病机制主要包括内皮细胞损伤-应答机制、脂质沉积、免疫细胞参与的炎症反应机制和血管平滑肌增殖和迁移机制。其中,内皮细胞损伤和/或死亡不仅在AS的早期阶段起着关键作用,而且与斑块进展和AS并发症的发生有关。AS的主要致病因素Blebbistatin抑制剂包括:高血脂、高血压、高血糖和吸烟等。据报道,高血脂、高血压、高血糖和尼古丁等刺激因素是引起内皮细胞损伤和/或死亡常见的诱因。值得注意的是,一系列研究中不难发现内皮细胞长期暴露于高血脂、高血压、高血糖和尼古丁等刺激因素下,内皮细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过度蓄积引起氧化应激损伤,甚至发生内皮细胞死亡,如细胞凋亡、细胞焦亡、PARP-1依赖的细胞死亡等。因此,ROS是高血脂、高血压、高血糖和尼古丁等刺激因素引起内皮细胞损伤和/或死亡的常见机制之一。近年来大量研究表明,细胞焦亡与AS的发生与发展密切相关。例如,在AS早期,内皮细胞焦亡,引起炎症因子释放、血管通透性增高以及单核细胞募集。在AS的进展期,细胞焦亡参与泡沫细胞的形成、巨噬细胞和和血管平滑肌细胞的迁移,进而加剧斑块内炎症反应以及坏死核的形成。细胞焦亡是一种由各种刺激引起的程序性炎症坏死,其特征在于炎症小体的组装与激活、膜孔的形成和促炎性细胞因子的成熟与释放。其中,NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡机制研究的最为广泛、最为透彻,并且NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡与ROS密切相关。在内皮细胞中,ROS被认为是高血脂、高血糖、尼古丁、高血压等刺激因素激活NLRP3炎症小体的桥梁。NLRP3炎性小体由胞内识别受体含有一个吡啶结构域3的NOD-样受体(NOD-like receptor containing a pyrin domain 3,NLRP3)、接头蛋白包含一个CARD的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和一个效应蛋白半胱天冬酶-1(caspase-1)构成。NLRP3炎症小体的激活本质上是caspase-1自身激活。活化的caspase-1能够介导IL-1β和IL-18的成熟。此外,活化的caspase-1能够促使膜孔蛋白Gasdermin D(GSDMD)的成熟,导致膜孔的形成。一方面,膜孔的形成不仅能够引起细胞膨胀甚至破裂,引起内皮细胞死亡。另一方面,膜孔的形成能够促进白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interluekin-18,IL-18)释放,维持和放大炎症反应。此外,NLRP3炎症小体激活破坏了内皮间紧密连接屏障,导致血液中的有形成分外渗,如脂质的沉积促进AS斑块的形成。NLRP3炎症小体活化后能够上调ICAM-1的表达,介导白细胞与内皮细胞黏附,引起白细胞外渗,进而参与AS斑块内的炎症反应。因此,ROS触发NLRP3炎症小体介导内皮细胞焦亡机制与AS的发生与发展密切相关。内皮细胞长期暴露于高血糖、高血脂、尼古丁、高血压等刺激因素下,ROS主要来源于线粒体,NADPH氧化酶和e NOS“解耦联”。过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)是主要的ROS种类之一。H_2O_2在热力学上不稳定,很容易分解形成水和氧气。叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)是一种广泛应用于各种氧化过程的有机过氧化物,在氧化应激研究中被广泛用作H_2O_2更好的替代品。据报道,t-BHP能够引起内皮细胞发生氧化应激,并且不同浓度的t-BHP能够引起内皮细胞不同死亡方式。低浓度t-BHP(50μM)能够触发内皮细胞发生细胞凋亡,而高浓度t-BHP(500μM)能够引起内皮细胞发生坏死性凋亡。然而,在内皮细胞中t-BHP是否能够触发NLRP3介导的细胞焦亡尚未清楚。近期,本研究首次探讨了t-BHP触发人脐静脉内皮(human umbilical vein endothelium,HUVEC)氧化应激损伤及其NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡的机制,为CHD的研究提供新的思路。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一种长度约为19～22nt进化上高度保守的非编码RNA,能够在转录后调节基因表达。miRNA通过结合m RNA的3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)在RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)中降解m RNA或抑制其翻译。越来越多的证据表明miRNAs在心血管疾病发展中起着关键作用,这表明miRNAs可以被认为是治疗心血管疾病的潜在的小分子药物。据报道,氧化应激会刺激几种miRNA的产生,这些miRNA被定义为氧化应激反应性miRNA。miR-144就是一种经典的氧化应激反应性miRNA。值得注意的是,一些研究表明miR-144在内皮细胞损伤中起到重要作用。例如,据报道,胆固醇能够引起内皮细胞中miR-144表达升高,导致减弱NO生物利用度下降,从而引起内皮功能障碍。有研究发现,沉默miR-144能够缓解雄性小鼠的AS。本研究进一步探讨在t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤模型中,NF-κB1/miR-144-3p/FOXP1轴对细胞焦亡的调控作用,为CHD的研究和治疗提供新的治疗靶点。研究目的本研究应用t-BHP诱导HUVEC氧化应激损伤模型,探讨t-BHP触发细胞焦亡机制。此外,本研究在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,深入探讨了NF-κB1/miR-144-3p/FOXP1轴对细胞焦亡的调控机制。研究方法1.分别用0,25μM,50μM,100μM t-BHP作用于HUVECs 1h。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率,检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western bolt技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,ASC,C-caspase-1,Pro-IL-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。应用蛋白质免疫共沉淀技术明确最适浓度下,NLRP3炎症小体组装情况。2.以50μM t-BHP分别作用于HUVECs 0,0.5h,1h和1.5h。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率,通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western bolt技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,ASC,C-caspase-1,Pro-IL-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。3.探讨敲低NLRP3是否能缓解t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤及细胞焦亡。应用RT-q PCR和Western blot技术检测si-NLRP3转染效率。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白C-caspase-1,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。4.明确敲低ASC是否能缓解t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤模型。应用RT-q PCR和Western blot技术检测si-ASC转染效率。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白C-caspase-1,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。5.研究caspase-1抑制剂VX-765是否能够缓解t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤模型。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白C-caspase-1,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。6.应用不同浓度的t-BHP作用于HUVECs,构建HUVECs氧化应激损伤模型,应用RT-q PCR检测pri-miR-144和miR-144-3p的变化趋势。此外,以50μM t-BHP不同的时间点作用于HUVECs,构建HUVECs氧化应激损伤模型,应用RT-q PCR检测pri-miR-144和miR-144-3p的变化趋势。7.研究NF-κB1对MIR-144转录起始调控机制。应用t-BHP构建HUVECs氧化应激损伤模型,同时敲低NF-κB1的表达,通过RT-q PCR检测pri-miR-144-3p和miR-144-3p表达情况。应用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)证明NF-κB1是否能够与MIR-144转录起始区域结合。利用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB1是否能够激活MIR-144转录。8.应用miR-144-3p mimics对HUVECs进行转染,明确过表达miR-144-3p是否能够引起细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,ASC,C-caspase-1,Pro-IL-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。9.应用miR-144-3p inhibitor对HUVECs进行转染,明确敲低miR-144-3p表达是否能够缓解t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。应用RT-q PCR检测转染效率。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,ASC,C-caspase-1,Pro-IL-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。10.明确miR-144-3p是否靶向调控Foxp1。在HUVECs中过表达miR-144-3p后,应用RT-q PCR和Western Blot检测Foxp1的表达情况。在HUVEC氧化应激损伤模型中敲低miR-144-3p后,应用RT-q PCR和Western blot检测Foxp1的表达情况。此外,应用双荧光素酶报告基因实验明确miR-144-3p与Foxp1 m RNA3’-UTR结合。11.在HUVECs氧化应激模型中同时转染miR-144-3p inhibitor和si-Foxp1,探讨miR-144-3p是否通过Foxp1介导HUVECs氧化应激损伤及细胞焦亡。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,C-caspase-1,Pro-IL-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。12.在HUVECs氧化应激模型中过表达Foxp1,明确Foxp1是否能够缓解t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。通过CCK-8法评估内皮细胞生存率。通过检测细胞上清中LDH的活性来判断细胞损伤情况。同时使用Western blot技术检测细胞中细胞焦亡标志性蛋白NLRP3,Pro-caspase1,C-caspase-1,Pro-I寻找更多L-1β,C-IL-1β以及N-GSDMD的表达水平。研究结果1.随着t-BHP浓度升高,HUVECs生存率逐渐降低,细胞上清中LDH活性逐渐升高。通过Western blot检测发现,随着t-BHP浓度升高,细胞焦亡相关蛋白的表达水平表达水平逐渐增加。t-BHP浓度在50μM时,细胞焦亡相关蛋白表达最高。同时,通过CO-IP检测发现,t-BHP浓度在50μM时,NLRP3炎症小体显著形成。2.以50μM t-BHP不同的时间点作用于HUVECs,随着t-BHP诱导时间增加,HUVECs生存率逐渐降低,细胞上清中LDH活性逐渐升高。Western blot检测发现,随着t-BHP诱导时间增加,细胞焦亡相关蛋白的表达水平逐渐增加。3.在t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤模型中敲低NLRP3的表达,HUVECs生存率升高,细胞上清中LDH活性降低,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低。4.在HUVECs氧化应激损伤模型中敲低ASC的表达,HUVECs细胞生存率升高,细胞上清中LDH活性降低。Western blot结果表明,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低。5.在HUVEC氧化应激损伤模型中加入caspase-1抑制剂VX-765,HUVECs细胞生存率升高,细胞上清中LDH活性降低。Western blot结果表明,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低。adult medicine6.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,pri-miR-144和miR-144-3p表达升高,并且呈剂量依赖性和时间依赖性。7.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,敲低NF-κB1的表达,pri-miR-144和miR-144-3p表达显著下降。Ch IP实验结果表明,在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,NF-κB1能够与MIR-144启动子区结合。双荧光素酶报告基因实验表明,NF-κB1能够激活MIR-144的转录。8.在HUVECs中过表达miR-144-3p,HUVECs细胞生存率降低,LDH活性升高。Western blot检测发现,细胞焦亡相关蛋白的表达水平增加。9.在t-BHP构建HUVEC氧化应激损伤模型中,敲低miR-144-3p的表达,HUVECs细胞生存率升高,LDH活性降低。Western blot检测发现,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低。10.在HUVECs中过表达miR-144-3p,Foxp1 m RNA和蛋白水平表达下降。在t-BHP构建HUVECs氧化应激模损伤模型中,敲低miR-144-3p的表达,Foxp1m RNA和蛋白水平表达升高。双荧光素酶报告基因实验检测发现,miR-144-3p能够与Foxp1 m RNA 3’-UTR结合。11.在t-BHP构建HUVECs氧化应激损伤模型中,同时敲低miR-144-3p和Foxp1的表达后,HUVECs细胞生存率下降,LDH活性升高。Western blot检测发现,细胞焦亡相关蛋白的表达水平升高。12.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,过表达Foxp1后,HUVECs细胞生存率升高,LDH活性降低。Western blot结果表明,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低。结论1.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,t-BHP引起HUVECs细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡呈浓度和时间依赖性。2.敲低NLRP3的表达能够缓解t-BHP诱导HUVECs细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。3.敲低ASC的表达能够缓解t-BHP诱导HUVECs细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。4.抑制caspase-1的活性能够缓解t-BHP诱导HUVECs细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。5.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,pri-miR-144和miR-144-3p表达升高。在HUVEC中过表达miR-144-3p引起HUVECs细胞损伤,促进NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,敲低miR-144-3p的表达能够缓解HUVECs细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。6.在t-BHP构建HUVECs氧化应激损伤模型中,NF-κB1是MIR-144的转录激活因子,促进MIR-144的转录。7.miR-144-3p通过靶向结合Foxp1 m RNA 3’-UTR,下调Foxp1的表达。8.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,miR-144-3p通过Foxp1介导HUVECs细胞损伤,促进NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。9.在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,过表达Foxp1能够缓解HUVEC细胞损伤及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。创新点及研究意义本研究应用t-BHP诱导HUVECs氧化应激损伤模型,在该模型中首次探讨t-BHP触发NLRP3炎症小体介导氧化应激损伤及细胞焦亡机制。此外,本研究在t-BHP构建HUVECs氧化应激模型中,深入揭示了NF-κB1/miR-144-3p/FOXP1轴对氧化应激损伤及细胞焦亡的调控机制,为冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究和治疗提供新的方向。