脓毒症是因宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍症候群,是重症监护病房住院患者死亡常见原因之一。长时间以来,肠道被认为在脓毒症的发生发展过程中起着至关重要的作用,是引起多器官功能障碍综合征的“motor”。肠道是机体和外部环境之间的防御屏障,能够阻止肠道内有毒介质和病原体进入循环。脓毒症期间肠道屏障受损使细菌和内毒素移位,并对远端器官结构和功能产生有害影响,导致多器官功能障碍综合征。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一种高效、高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂,具有良好镇静、易于唤醒而不引起明显呼吸抑制的作用,能显著减少病人术后谵妄,目前广泛应用于重症和围手术期患者。近年来右美托咪定对脓毒症器官功能的保护作用成为研究热点,有文献报道右美托咪定对脓毒症引起的肠道屏障损伤具有一定保护作用,但其对脓毒症肠道屏障功能发挥保护作用的机制如何?目前尚不清楚。巨噬细胞是肠道免疫屏障的重要组成部分,能启动并协调对突破肠上皮屏障的细菌产生有效免疫反应。大多数驻留的肠道巨噬细胞由血单核细胞补充。生理条件下,血液来源的单核细胞在肠道逐渐获得抗炎巨噬细胞的组织驻留表型,即M2巨噬细胞,通过分泌抗炎因子如IL-10等限制炎症。在脓毒症期间,机体处于炎症状态,血源性单核细胞在肠道则获得更多的促炎表型,即M1巨噬细胞,分泌高水平的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等,影响肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达和定位。有研究证明,M2型巨噬细胞促进肠上皮屏障的紧密性,而M1型巨噬细胞诱导肠屏障通透性增加。因此,巨噬细胞的极化表型与脓毒症肠道屏障功能密切相关。Dex是否通过调控巨噬细胞极化表型发挥对脓毒症肠道屏障功能的保护作用呢?不清楚。据此,本研究采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症模型以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)和RAW264.7细胞模型,分别从在体水平及离体水平研究右美托咪定对脓毒animal models of filovirus infection症大鼠肠道屏障功能的保护作用及机制,研究内容包括以下两部分:(1)右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用(2)右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究。研究内容:第一部分右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道通透性的影响制备CLP脓毒症模型,通过测定肠组织伊文思蓝(evans blue,EB)渗漏,ELISA法检测血清D-乳酸(d-lactic acid,D-lac)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)含量和炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平,以及HE染色观察肠组织病理结构情况,观察脓毒症后肠道屏障的损伤及Dex对脓毒症大鼠肠道通透性的影响。2.右美托咪定对脓毒症肠上皮细胞通透性的影响LPS刺激IEC复制脓毒症模型,采用免疫荧光染色和蛋白质印迹法(western blot,WB)检测IEC紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达,观察Dex对IEC通透性的影响。3.右美托咪定对脓毒症大鼠器官功能的影响检测脓毒症大鼠平均动脉压(mean arterial pressure,MAP),并取大鼠外周血分别检测血气、肝功能(谷丙转氨酶,ALT;谷草转氨酶,AST)、肾功能(肌酐,Crea)和心肌酶谱(肌酸激酶同工酶,CK-MB),观察Dex对脓毒症大鼠心肝肾等重要器官功能的保护作用。4.右美托咪定对脓毒症大鼠存活时间及存活率的影响制备CLP脓毒症Vorinostat分子式模型,观察Dex对脓毒症大鼠24h存活时间和存活率的影响。第二部分右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道巨噬细胞极化的影响通过CLP建立脓毒症模型,提取脓毒症大鼠肠组织制备成单细胞悬液,采用流式细胞术分选鉴定肠组织单细胞悬液中巨噬细胞极化类型亚型(CD86标记M1型巨噬细胞,CD206标记M2型巨噬细胞);利用免疫荧光染色标记脓毒症大鼠肠组织冰冻切片,观察肠组织中M1型巨噬细胞的含量,观察Dex对脓毒症大鼠肠组织巨噬细胞极化类型的影响。2.右美托咪定对LPS刺激的RAW264.7细胞极化的影响利用LPS刺激RAW264.7细胞复制脓毒症模型,采用免疫荧光染色、ELISA和WB检测M1、M2巨噬细胞相关标志物的表达,i NOS、TNF-α、IL-6、IL-β标记M1型巨噬细胞,用CD206和Arg1标记M2型巨噬细胞。3.代谢组学分析利用代谢组学对RAW264.7细胞内所有代谢物进行定量分析,使用KEGG分析对差异代谢物进行通路富集。4.右美托咪定调控巨噬细胞极化的机制根据代谢组学结果,采用ELISA法检测RAW264.7细胞代谢物谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,WB检测x CT和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达。同时用荧光探针观察Dex对活性氧ROS和Lipid ROS的影响。明确Dex是否通过影响x CT表达,促进GSH生成并激活GPX4,抑制巨噬细胞发生铁死亡,进而调控巨噬细胞极化类型。研究结果:第一部分右美托咪定对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道通透性的影响脓毒症后大鼠肠道通透性升高,表现为肠组织EB渗漏明显增加,D-lac和DAO含量显著升高,血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平明显增加,肠绒毛萎缩、断裂,大量红细胞和炎性细胞浸润;Dex治疗后,可以明显降低脓毒症大鼠肠道通透性,肠组织EB渗漏明显减少,血D-lac和DAO含量显著下降,炎症细胞因子TNF-α、IL-1β水平也明显降低,肠绒毛萎缩情况明显好转,红细胞及炎性细胞浸润减少。2.右美托咪定对脓毒症肠上皮细胞通透性的影响LPS刺激后IEC通透性显著增加,表现为ZO-1和Occludin表达减少,免疫荧光结果显示ZO-1表达减弱且明显断裂,成松散分布;经Dex处理后,IEC通透性显著改善,ZO-1和Occludin表达增加,免疫荧光示ZO-1表达明显增加,分布较连续和清晰。3.右美托咪定对脓毒症大鼠器官功能的影响脓PF-07321332核磁毒症术后大鼠肝肾及心肌功能损伤严重,动脉血压下降明显,p H与Pa O2均显著降低,Pa CO2显著升高;Dex治疗后,脓毒症大鼠肝肾及心肌功能损伤显著减轻,动脉血压升高,Pa O2与p H均显著升高,Pa CO2显著降低。4.右美托咪定对脓毒症大鼠存活时间及存活率的影响经脓毒症术后,大鼠的生存时间缩短,生存率大大降低;Dex治疗后,大鼠存活率显著增加,存活时间显著延长。第二部分右美托咪定调控巨噬细胞极化发挥肠道屏障保护的机制研究1.右美托咪定对脓毒症大鼠肠道巨噬细胞极化的影响脓毒症组大鼠肠道促炎M1型巨噬细胞数量增多,肠组织单细胞悬液内CD86(+)CD206(-)巨噬细胞显著增加,i NOS表达增加,提示脓毒症后肠道巨噬细胞主要向M1型极化;Dex治疗后,肠单细胞悬液内CD86(+)CD206(-)巨噬细胞数量明显减少,CD86(-)CD206(+)巨噬细胞数量明显增多,i NOS表达减少,提示Dex能抑制脓毒症肠道巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。2.右美托咪定对LPS刺激的RAW264.7细胞极化的影响LPS刺激后巨噬细胞向M1型极化明显,表现为i NOS表达显著增多,炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平增加;Dex处理后,i NOS表达明显减少,CD206和Arg1表达明显增加,这表明巨噬细胞向M1极化减少,而向M2表型极化增多。3.代谢组学分析代谢组学质谱分析结果显示Dex组和LPS组之间有274种差异代谢物,其中半胱氨酸和谷胱甘肽差异显著,用KEGG富集方法,对差异代谢物进行分析,结果发现半胱氨酸和谷胱甘肽与铁死亡通路密切相关。提示Dex治疗后可能通过调控铁死亡通路相关代谢产物,参与巨噬细胞极化调控。4.右美托咪定调控巨噬细胞极化的机制LPS刺激后,RAW264.7细胞内GSH含量下降,x CT和GPX4蛋白水平显著降低,ROS和Lipid ROS明显增加,巨噬细胞发生铁死亡;Dex处理后,GSH含量增多,x CT和GPX4表达明显增加,细胞内ROS和Lipid ROS均减少,表明Dex能减轻LPS引起的巨噬细胞铁死亡,进而抑制巨噬细胞向M1型极化。研究结论:1.Dex对脓毒症大鼠肠道屏障功能具有保护作用,通过抑制炎症反应,增加肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达,显著降低肠道通透性,同时脓毒症大鼠其他器官功能也受到了Dex的保护,最终改善了大鼠存活时间和生存率。2.Dex能明显减少脓毒症大鼠肠道炎性M1巨噬细胞数量,促进巨噬细胞向抗炎M2型极化,抑制炎症细胞因子分泌,进而发挥对脓毒症大鼠肠道屏障功能的保护作用。3.Dex通过影响转运蛋白x CT,增加巨噬细胞内GSH含量和GPX4的表达,从而减少胞内ROS和Lipid ROS水平,减轻巨噬细胞铁死亡,进而抑制巨噬细胞向促炎M1型极化。