燕子花(Iris laPathologic downstagingevigata)是鸢尾属中极其耐寒的种类,是东北地区园林绿化中非常重要的水生花卉。自然界中的燕子花花色多为蓝色,因其花色不够丰富,园林应用中希望在燕子花花色育种上有所突破,满足人们对花色多样性的需求。随着基因工程在花色育种中的应用,给燕子花的花色育种提供了新思路,花色呈色、变异机理的研究对于基因工程育种的开展非常必要。课题组于野外发现燕子花的白花变种,但其花色发生变异的机理尚不清楚,白花燕子花(I.laevigata var.alba)的发现为解析燕子花花色变异机理研究提供了非常好的材料。本研究以燕子花(IB)及白花燕子花(IW)的花被片为材料,基于代谢组学分析,从花色变异的物质基础着手,结合转录组和蛋白质组分析,获得花色调控关键基因并进行调控功能验证,深入解析了燕子花花色变异机制。主要研究成果如下:(1)应用广泛靶向代谢组学分析得出花青素是IB呈色的物质基础。IW中也含有花青素,但IB中花青素的种类和含量显著高于IW,尤其是飞燕草色素。IW中以原花青素合成为主,使得花青素合成受阻,是IW花色形成的重要原因。(2)利用三代转录组测序构建了2个Pac Bio Iso Seq文库,去冗余后共得到835,813个转录本。以三代全长转录本为参考,进行二代转录组测序,得到IB和IW的差异表达基因(DEGs)15930个。对DEGs进行GO和KEGG富集分析,筛选到花青素合成相关的23个结构基因和9个转录因子。转录组和代谢组联合分析鉴定到参与花色变异的11个DEGs,包括Il CHS、Il CHI-1、Il CHI-2、Il F3H、Il ANS、Il ANR、Il MYB3、Il MYB4、Il MYB5、Ilb HLH2和Ilb HLH3。(3)利用i TRAQ技术,在IB和IW中共鉴定到1723个差异表达蛋白(DEPs),对DEPs进行GO和KEGG富集分析,筛选到参与花青素合成的7个结构基因和3个转录因子。转录组和蛋白质组联合分析鉴定到参与花色变异的6个DEGs,包括Il CHI-1、Il CHI-2、Il ANR、Il MYB4、Il MYB5和Ilb HLH3。多组学联合分析得出Il ANR是IW产生白花变异的关键结构基因,Il MYB4、Il MYB5和Ilb HLH3是调控燕子花产生花色变异的关键转录因子。(4)从燕子花中克隆了4个参与花色变异的关键基因Il MYB4(OQ243217)、Il MYB5(OQ243218)、Ilb HLH3(OQ243219)和Il ANR(OQ433948),构建植物过表达载体并通过叶盘法遗传转化烟草,获得了T_3代纯合转基因过表达株系(OE-Il MYB4、OE-Il MYB5、OE-Ilb HLH3、OE-Il ANR)。与野生型(WT)相比,OE-Il MYB4、OE-Il ANR使得烟草花冠颜色变浅,Il MYB4是通过上调ANR基因的表达实现的花色改变;OE-Il MYB5和OE-Ilb HLH3通过上调HY5和UFGT基因的表达使得转基因烟草花冠的着色期提前、颜色加深。此外发现Il MYB4还参与叶形、叶色、雌蕊发育、叶腋处的分枝等性状调控。(5)RT-q PCR检测了Il MYB4、Il MYB5、Ilb HLH3在IB和IW在花被片未着色(S1)、开始着色(S2)、完成着色(S3)及完全盛开(S4)4个不同时期和不同组织部位的表达模式,发现Baf-A1价格Il MYB4、Il MYB5、Ilb HLH3均在花中优势表达,在IB的S1-S4时期中Ilb HLH3表达量最高,其次是Il MYB5;在IW的S1-S3时期,Ilb HLH3表达量最高,其次是Il MYB4,在S4时期,Ilb HLH3和Il MYB5相对表达量下降,且均低于Il MYB4。Il MYB4、Il MYB5和Ilb HLH3蛋白均作用于细胞核,酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Il MYB4、Il MYB5都与Ilb HLH3蛋白互作。(6)FPNI-PCR克隆得到Il ANR基因的启动子序列1520bp,其中不仅包含了高等植物启动子元件,还含有一些与植物的生长发育相关的其它作用元件及MYB结合位点。酵母单杂交实验表明Il MYB4可以结合Il ANR的启动子P1处的位点来调控Il ANR的表达,通过双荧光素酶实验得出Il MYB4与Ilb HLH3互作可以促进Il ANR的转录表达,致使白花燕子花中类黄酮生Pevonedistat NMR物合成途径以表儿茶素等原花青素类物质合成为主,花青素合成受阻。