HER2的过表达与多种肿瘤的发生发展密切相关,近年来,关于HER2突变与不良预后的报道日益增多。HER2 S310F是HER2基因中最为高频的突变,并且该位点位于帕妥珠单抗结合HER2蛋白的关键表位,除了具有促进癌症发生发展的驱动作用,还能够阻断治疗药物的结合,从而产生耐药现象。循环肿瘤DNA(ct DNA)是精准医学中的一种微创液体活检工具,血液中的ct DNA反映了肿瘤的发展情况及原发性和转移性肿瘤中存在的基因组改变,对ct DNA进行分析有助于对患者进行耐药监测,规避无效的治疗方案及由其带来的副作用,也能为患者省去不必要的费用。基于ct DNA特定突变的检测已被写入部分肿瘤的临床诊疗指南,用于预测抗肿瘤药物的疗效和伴随诊断。但由于低浓度,高碎片化以及与正常DNA片段的高度混合,患者中ct DNA比例相当低且变化很大。因此,检测ct DNA中的肿瘤特异性突变所面临的主要挑战是达到可接受的灵敏度和特异性水平。目前,FDA批准的用于临床的伴随诊断主要是基于下一代测序(NGS)SB431542技术检测ct DNA中的热点突变,然而NGS技术成本高,对于许多患者来说难以负担。因此,开发一种新的、灵敏度较高的、成本较低的用于ct DNA检测的技术意义重大。环介导等温扩增(LAMP)就是这样一种技术。近年来,发展出了一系列基于LAMP的方法,显示出了在DNA突变检测中的巨大潜力,并且还为疾病诊断、个性化治疗和精准医学研究提供了新的思路。本课题组前期针对HER2 S310F进行了较为成熟的研究,在此基础上,本研究首先通过生物信息学方法进行了HER2突变与不同肿瘤患者生存情况、免疫浸润、基因表达三方面的分析,发现了HER2突变与多种肿瘤患者的不良预后密切相关,其中,发生HER2 S310F突变的患者与未发生该突变的患者的总体生存期显示出了显著性差异。接着,基于LASCH772984试剂MP技术原理,通过优化引物浓度、扩增温度、Bst 2.0 DNA聚合酶用量等条件,我们针对HER2 S310F建立了低成本、高灵敏度的LAMP-OSD检测方法,在质粒水平上,检测灵敏度可达到0.05%。随后通过对LAMP-OSD法进行改进,我们将引物FIP/BIP中部分碱基进行硫代(PS)修饰,PS修饰后,能够产生除了正常扩增途径外的扩增途径,提高扩增效率。建立的PS-LAMP-OSD法除了可以应用于耐药突变HER2 S310F的检测,还可应用于HER2 S310Y/A的检测,在质粒水平上,灵敏度均可达到0.005%Hollow fiber bioreactors,相比于LAMPOSD法,灵敏度提高了10倍。为模拟人外周血游离DNA,我们选取H460细胞基因组作为野生型模板,S310F/Y/A突变型质粒DNA作为突变型模板,通过优化破碎条件,最终使野生型和突变型DNA片段化长度与游离DNA主要片段长度相符。随后,在模拟液体活检水平上,我们对S310F/Y/A突变建立了检测标准曲线,检测灵敏度达到0.05%,优于现有的检测方法。接着,通过设计共用引物和三组探针组,在优化三组探针组的比例后,利用已建立的检测体系,我们实现了针对HER2基因同一位点不同突变的检测。在LAMP-OSD法体系中,不同探针比例均对HER2 S310F、310A显示出较好的区分,但不易区分HER2 310Y与野生型。相比之下,在PS-LAMP-OSD法体系中,优化后的探针比例能实现对三种突变的显著区分,对使用帕妥珠单抗进行治疗的肿瘤患者的耐药监测具有重要意义。本研究所建立的检测方法具有巨大的潜力,有望成为目前使用的高成本液体活检技术的经济有效的替代方法,有望作为使用帕妥珠单抗进行治疗的肿瘤患者开展S310F/Y/A突变检测的伴随诊断,一旦患者在治疗过程中检测到S310F突变,就必须及时更换治疗方案,避免延误治疗时机,耽误病情,从而实现最大程度上的临床获益。