第一章铁死亡相关基因对DLBCL的预后价值及预后模型研究研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种高度异质性的B细胞淋巴瘤。多组学的研究和应用,加深了人们对DLBCL分子特征的认识。分子标记物也成为预测DLBCL预后的有效工具。铁死亡是一种由脂质过氧化引起的铁依赖的程序性死亡。多个DLBCL细胞系对铁死亡诱导剂敏感性较高。一些铁死亡诱导剂对DLBCL有治疗作用,提示铁死亡可能参与DLBCL的发生和发展。因此探讨铁死亡相关基因对DLBCL预后的影响十分必要。研究方法1.在GEO数据库中检索与DLBCL患者相关的数据集。从中找到包含DLBCL样本和正常对照样本的数据集,作为差异表达分析的数据集。从中找到包含随访数据的数据集,作为建立和验证DLBCL预后模型的数据集。2.对GSE56315和GSE25938进行差异表达分析(P<0.05,log_2FC>2),与铁死亡相关基因取交集,作为差异表达的铁死亡相关基因(DEFRGs)。3.使用Metascape网站对DEFRGs进行GO/KEGG富集分析,利用网站的PPI插件和MCODE插件,得到蛋白质相互作用(PPI)网络。4.单因素Cox回归分析数据集GSE31312中DEFRGs与DLBCL患者总生存期的相关性。5.LASSO-Cox回归分析数据集GSE31312中DEFRGs是否为DLBCL的独立预后因素,并建立DLBCL的总生存期预后模型。6.计算模型的危险评分,将患者分为高危组和低危组。绘制生存曲线、时间依赖ROC曲线分析模型的预测效能。7.利用数据集GSE34171验证DLBCL的总生存期预后模型。8.使用R软件及多个R包绘制差异表达分析结果火山图和PCA图、单因素Cox回归结果的森林图和LASSO-Cox回归结果的森林图。研究结果1.检索GEO数据库后,找到了59个含DLBCL的高通量测序数据的数据集。2.对GSE56315进行差异表达分析,得到3752个上调基因和5041个下调基因。对GSE25638进行差异表达分析后,找到2270个上调基因和554个下调基因。3.将差异表达基因与铁死亡相关基因取交集,得到了152个差异表达的铁死亡相关基因(DEFRGs)。4.利用Metascape网站对152个DEFRGs进行基因本体(GO)富集分析,富集到的前三个为生物过程,分别是细胞对化学应激的应答、对营养水平的应答和调控自噬。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析后,富集到的前三个通路分别是铁死亡、自噬和脂质与动脉粥样硬化。从PPI网络中找到7个蛋白质密集连接的簇(MCODE)。5.单因素Cox回归分析后,数据集GSE31312中41个DEFRGs与DLBCL患者总生存期相关。6.LASSO-Cox回归分析后,数据集GSE31312中SLC7A5、MT3、AURKA、AKR1C3、PEBP1、NGB、TUBE1和GPX2是OS的独立危险因子,IDH1、ATG16L1、CISD2为OS的独立保护因子。7.利用数据集GSE31312建立DLBCL的铁死亡相关基因的总生存期预后模型。时间依赖的ROC曲线对1年、3年、5年的总生存率的曲线下面积分别为0.778,0.787和0.809。该模型对总生存期有较好的预测能力。8.利用数据集GSE34171验证预后模型。时间依赖的ROC曲线中1年AUC最高为0.870。研究结论利用GEO数据库的DLBCL患者相关数据集和铁死亡相关基因,找到41个与DLBCL总生存期相关的基因,其中包括8个独立危险因子和4个独立保护因子。由此建立的关于DLBCL总生存期的铁死亡相关基因预后模型,具有较好的预测能力。此预后模型可用于患者的分层管理,相关基因的靶向药物可能用于DLBCL的治疗。第二章PET/CT半定量参数对DLBCL的预后价值及预后模型研究研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)在临床病理特征、对治疗反应和预后方面有高度的异质性。临床常用的国际预后指数(IPI)评分在利妥昔单抗时代已不能满足需求,特别是对于总生存率小于50%的高危人群。临床常使用多维尔标准分析PET/CT,但更多可能性未被发现。已被报道的对DLBCL有预后价值的基线PET/CT半定量参数包括如病灶的标准摄取值(SUV)、肿瘤代谢总体积(t MTV)和糖酵解总量(TLG)等。新型PET/CT半定量参数,如肿瘤与纵膈血池最大标准摄取值的比(TBR)和肿瘤与肝脏最大标准摄取值的比(TLR)对霍奇金淋巴瘤的无进展生存期和总生存期有预测作用,但在DLBCL中暂无相关研究。因此有必要研究TLR和TBR对DLBCL预后的影响。研究方法纳入2010年至2018年经本院病理学确诊并规范治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者102例。1.收集患者的临床信息并进行描述性统计。2.使用LIFEx软件识别基线PET/CT图像中的半定量参数,包括最大单位体重标准摄取值(SUVmaxbw)、最大单位瘦体重标准摄取值(SUVmaxlbm)、最大单位体表面积标准摄取值(SUVmaxbsa)、TLG、t MTV、纵隔血池最大标准摄取值(SUVbloodpool)、肝脏最大标准摄取值(SUVliver),并通过计算得到TLR和TBR。3.使用X-tile软件找到各影像参数的最佳截断值,并将参数二分类。4.随访患者后,单因素Cox回归分析患者的临床参数和PET/CT半定量参数与无进展生存期和总生存期的相关性。5.LASSO-Cox回归分析临床参数和影像学参数是否为DLBCL的独立预后因素,并据此建立DLBCL预后模型。6.使用时间依赖ROC曲线分析DLBCL预后模型的预测效能。7.使用R软件及多个R包绘制生存曲线、预后模型的列线图、单因素Cox回归结果和LASSO-Cox回归结果的森林图。研究结果1.共纳入102名DLBCL患者,中位随访时间为55个月。除SUVliver外,各临床参数和影像学参数在对治疗有反应组和无反应组间没有统计学差异。2.使用X-tile软件得到的影像学参数SUVbloodpool、SUVliver、SUVmaxbw、SUVmaxlbm、SUVmaxbsa、TLR、TBR、TLG、t MTV和病灶数的无进展生存期相关的最佳截断值分别是0.90、1.20、30.85、19.26、5.42、16.91、20.96、7841、62、129.48和5。3.单因素Cox回归分析后,3个临床参数与无进展生存期相关,分别是分期(P<0.05)、LDH(P<0.05)和B2M(P<0.01)。7个PET/CT半定量参数与无进展生存期相关,分别是病灶数(P<0.001)、SUVbloodpool(P=0.002)、TBR(P=0.003)、TLG(P=0.003)、t MTV(P=0.003)、TLR(P=0.008)和SUVliver(P=0.027)。同样的10个参数也与总生存期相关(P值不相同)。4.LASSO-Cox回归分析结果提示,TBR(P=0.001)和病灶数(P<0.001)是无进展生存期的独立危险因素,也是总生存期的独立危险因素(二者均P<0.001)。5.PFS预后模型包含四个参数,分别为TBR、病灶数、LDH和TLG;OS预后模型包含四个参数,分别为TBR、病灶数、LDH和B2M。PFS预后模型的1年AUC、3年AUC和5年AUC为0.720、0.747和0.759。OS预后模型的1年AUC、3年AUC和5年AUC为0.716、0.782和0.787。模型具有较好的预测能力。研究结论TBR是DLBCL患者无进展生存期和总生存期的独立危险因素。联合临床参数和PET/CT半定量参数建立的PFS预后模型和OS预后模型有较好的预测能力。第三章PRMT1调控急性髓系白血病铁死亡及其机制研究研究背景急性髓系白血病(AML)是一种源自造血干/祖细胞的血液系统恶性肿瘤。尽管传统标准治疗能够达到一定的缓解效果,但复发和难治仍然是当前急需解决的问题。深入探索AML的发病机制,开发新的治疗靶点和疗法对于提高AML的缓解率和生存率具有重要意义。近年的研究表明,表观遗传异常在AML中起着重要的作用,在AML的广泛应用中,针对表观遗传因子具有很大的潜力。另一方面,研究表明铁死亡是一种新的调节性细胞死亡方式,以铁的依赖性和脂质过氧化的积累为特征。然而,在AML中,表观遗传因子如何调控铁死亡以及铁死亡诱导剂和表观遗传药物的联合治疗在AML中是否具有治疗价值仍不清楚。本研究旨在探究AML细胞中表观遗传调控铁死亡敏感性的机制及相关的分子机制。研究方法本研究综合运用了细胞实验、数据库分析、动物实验和多组学分析等方法。在细胞实验中,我们选择了代表性的AML细胞系(如NB4,HEL,MOLM-13)作为主要研究对象;在动物实验中,我们采用雌性裸鼠建立了AML异种移植瘤模型。1.通过细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法检测细胞的增殖活性;2.利用BODIPY-C11(581/591)和Ferro Orange流式染色,检测细胞中脂质过氧化水平和Fe2+含量;3.利用公共数据库(如TCGA、GTEx和Blood Spot),分析PRMT1在不同肿瘤中的表达情况,并通过GEPIA 2数据库研究PRMT1和ACSL1基因的相关性;4.利用CRISPR/Cas9技术构建PRMT1、ACSL1、ACSL3和ACSL5基因的敲除细胞,并通过蛋白免疫印迹检测敲除效率;5.通过异种移植瘤模型,评估GSK3368715联合RSL3对肿瘤的体内抑制作用;6.利用纳米孔测序技术分析GSK3368715处理后铁死亡相关基因表达差异,并通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹验证差异基因的表达情况;7.利用Cut&Tag技术,研究H4R3me2a和H3R17me2a修饰在全基因组和ACSL1启动子附近的分布情况。研究结果经表观抑制剂筛选,我们发现I型PRMTs抑制剂GSK3368715与铁死亡诱导剂RSL3和FIN56联合应用,能够显著抑制多种AML细胞系的活性。通过Bliss独立模型确认了它们的协同作用。通过BODIPY-C11(581/591)和Ferro Orange流式染色进一步证实,GSK3368715与铁死亡诱导剂联合应用能够有效诱导AML细胞死亡,显著提高铁死亡的关键指标水平,并且这种效应可以被铁死亡抑制剂Fer-1、Lip1和DFO所恢复。当敲除AML细胞中的PRMT1后,观察到类似于GSK3368715的促进铁死亡的效应,表明GSK3368715主要通过靶向PRMT1,从而增加AML细胞对铁死亡的敏感性。GSK3368715与RSL3联合应用在AML异种移植瘤模型中能够有效抑制皮下肿瘤的生长,而且没有明显的体重下降。ONT-seq结果显示,GSK3368715改变了一系列与铁死亡相关的基因的表达,包括ACSL1、ACSL3、ACSL5、CYBB、POR、FTH1、PEX10和PEX12基因。通过q Timed Up and GoRT-PCR和WB进一步证实了GSAM-2282生产商K3368715处理前后ACSL1、ACSL3和ACSL5基因的差异表达。在敲除AML细胞中的ACSL1、ACSL3和ACSL5基因后发现,只有ACSL1敲除能够恢复GSK3368715对促进铁死亡的效应。同时,PRMT1的敲除能够显著增加AML细胞中ACSL1蛋白的水平,GEPIA 2数据库分析也提示PRMT1和ACSL1在AML和广泛癌症中呈负相关。通过CUT&Tag技术PLX3397细胞培养进一步研究了GSK3368715处理后全基因组H4R3me2a(PRMT1介导)和H3R17me2a(CARM1/PRMT4介导)的变化。CUT&Tag结果显示,H4R3me2a和H3R17me2a主要富集在转录起始位点附近,GSK3368715可以显著降低全基因组H4R3me2a的水平,对H3R17me2a没有明显影响;此外,GSK3368715还导致ACSL1基因启动子区域的H4R3me2a水平显著降低。研究结论PRMT1在调控AML细胞的铁死亡敏感性方面发挥作用,抑制PRMT1可以通过增加ACSL1的表达来促进AML细胞的铁死亡。研究还发现,GSK3368715导致ACSL1启动子区域的H4R3me2a修饰水平降低。这些发现在深入理解PRMT1在AML发生和发展中的作用方面具有重要意义,靶向表观调控因子与铁死亡诱导剂的联合治疗在AML中具有潜在的应用价值。