研究背景:胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤,其中半数以上为胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)。目前胶质瘤的术后辅助治疗方式越来越多,比如放疗、化疗、电场治疗、靶向治疗、纳米催化治疗等,但胶质瘤患者预后依然不佳,这主要是由于胶质瘤的高异质性,其高异质性导致胶质瘤患者对各种辅助治疗表现出不同的敏感性;因此,制定个体化治疗方案对胶质瘤患者的预后至关重要。目前研究人员一般利用患者来源的原代肿瘤细胞、类器官或肿瘤异种移植(Patient-derived tumor xenograft,PDX)模型进行药敏检测;或者首先通过测序技术预测患者特异性的治疗方式,再利用前述的生物材料进行药敏检测,制定疗效最佳的胶质瘤个体化治疗方案。然而,这种检测方案需要结合传统的生物学实验来评估治疗效果,经典的标记检测方法耗时较长且检测流程繁琐,而无标记的光谱和电化学检测技术灵敏度较低,容易出现假阳性。因此,迫切需要一种新的技术来快速、精准地评估辅助治疗效果,指导脑胶质瘤个体化治疗方案的制定。太赫兹(terahertz,THz)波是一种频率波段在0.1-10THz的电磁波,许多生物大分子(蛋白质、DNA等)的旋转振动能级均处于该波段,且其能量低、穿透性强、方向性好。近年来,结合超材料(metamaterials,MTMs)提高检测灵敏度的THz技术得到迅猛发展,并广泛应用于生物分子指标和细胞学特征检测等生物医学领域,为快速、精准地评估辅助治疗效果带来了可能。目的:辅助治FG-4592配制疗处理胶质瘤细胞,会导致胶质瘤细胞发生两种改变,即细胞数量减少和活性状态降低。因此,我们希望设计一种新型MTMs生物传感器基于THz技术来实时监测辅助治疗处理下胶质瘤的细胞数量和活性状态变化,实现快速精准地放疗、化疗和靶向治疗等辅助治疗效果评估,为脑胶质瘤个体化治疗方案的制定提供指导。方法:1.生物传感器的组成及性能检测(1)经过标准制作流程(旋涂、紫外线光刻、显影和蒸镀)利用金及石英设计并制作了“插指样”电L-C MTMs(ELC-MTMs)生物传感器芯片;利用Ansys高频结构模拟器(High frequency structure simulator,HFSS)有限元方法对所设计的MTMs生物传感器芯片进行周期边界模拟和优化。(2)利用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)溶液及固化剂,借助标准模具合成适配MTMs芯片的PDMS腔,并将二者组装成ELC-MTMs生物传感器。3种常见的GBM细胞系(U251,LN229,A172)和3例患者来源的原代胶质瘤细胞系被培养在生物传感器芯片表面,显微镜下观察细胞生长状态。(3)太赫兹ELC-MTMs生物传感器检测流程及影响因素分析:1)待检物放置在生物传感器芯片表面;2)利用太赫兹ELC-MTMs生物传感器表征太赫兹频域光谱(Terahertz frequency domain spectrum,THz-FDS);3)改变待检物的理化性质后再次表征 THz-FDS。2.胶质瘤细胞数量和活性状态对频率偏移Δf的影响辅助治疗处理胶质瘤细胞,会导致胶质瘤细胞发生两种改变,即细胞数量减少和活性状态降低,同时,这也是传统生物学实验评估辅助治疗杀伤效果的两个关键指标。这里,我们以胶质瘤细胞凋亡情况反映活性状态。(1)不同数量的GBM细胞(U251,LN229,A172)培养在MTMs芯片表面,在不进行任何处理的情况下,利用太赫兹ELC-MTMs生物传感器表征THz-FDS。(2)三种化疗药物[替莫唑胺(Temozolomide,TMZ),洛莫司汀(Lomustine,LOM),依托泊苷(Etoposide,ETO)]购买VE-822和放射治疗(Ionizingradiation,IR)以不同药物浓度/不同剂量处理胶质瘤细胞后,CellDrop BF细胞计数仪计数获得每组特定数量(3×104)但状态不同的GBM细胞,并将其培养在MTMs芯片表面。太赫兹ELC-MTMs生物传感器表征各组THz-FDS,流式细胞术检测各组凋亡特征。(3)相同数量的GBM细胞培养在MTMs芯片表面,前述三种化疗药物和IR以不同药物浓度/不同剂量处理胶质瘤细胞后,表征各组THz-FDS,同时获得频率偏移Δf与细胞数量和活性状态的精准关系。前述3种化疗药物及放射治疗处理3种GBM细胞系,基于频率偏移Δf评估杀伤效果,同时利用流式细胞术及5-乙基-20-脱氧尿苷(5-ethyl-20-deoxyuridine,EdU)细胞增殖实验检测胶质瘤细胞凋亡和增殖进行验证。3.太赫兹ELC-MTMs生物传感器筛选个体胶质瘤最佳治疗方案(1)2022年脑胶质瘤诊疗指南推荐的4种化疗药物[TMZ,LOM,ETO,顺铂(Cisplatin,Cis)]及4种靶向治疗药物[IDH1突变体酶的抑制剂(Ivosidenib,AG120),B-RAF选择性抑制剂维莫非尼(Vemurafenib,PLX4032),FGFR-TACC抑制剂厄达替尼(Erdafitinib),mTOR信号通路抑制剂(Voxtalisib)]处理3例患者来源的原代胶质瘤细胞(LG-22-19,LG-22-20,LG-22-32),利用太赫兹ELC-MTMs生物传感器筛选个体胶质瘤最佳治疗方式。(2)利用流式细胞术及EdU细胞增殖检测验证筛选准确性。(3)核对胶质瘤患者的术中自动整合基因检测系统(automatic integrated gene detection system,AIGS)和术后下一代测序(next-generation sequencing,NGS)结果分析太赫兹ELC-MTMs生物传感器的筛选结果。结果:1.生物传感器的组成及性能检测(1)自主研发的全新的太赫兹ELC-MTMs生物传感器比传统MTMs生物传感器提高了 6.2倍的有效面积比,在380 GHz下每折射率(refractive index unit,RIU)可获得74 GHz的高灵敏度。(2)胶质瘤细胞在生物传感器芯片表面生长状态良好,且添加了 PDMS型细胞培养腔的MTMs芯片表面的细胞生长更加均匀。(3)太赫兹ELC-MTMs生物传感器可以在5分钟时间内获得待检物的THz-FDS,待检物物理性质(厚度、底表面积等)及化学性质(折射率等)的变化会导致THz-FDS发生频率偏移Δf。2.胶质瘤细胞数量和活性状态对频率偏移Δf的影响(1)在没有任何处理的情况下,太赫兹ELC-MTMs生物传感器检测到频率偏移Δf与细胞数量nc呈正相关,细胞数量越少Δf越小。(2)对不同放疗剂量和不同化疗药物浓度处理下特定数量的胶质瘤细胞进行THz-FDS以及流式细胞凋亡检测,结果提示频率偏移Δf与凋亡率ηa呈负相关,细胞活性状态越差Δf越小。(3)基于前述频率偏移Δf与细胞数量nc和凋亡率ηa的关系,对不同细胞数量、不同活性状态的胶质瘤细胞进行THz-FDS检测,结果提示Δf是胶质瘤细胞数量和活性状态的综合指标,不同治疗措施处理胶质瘤细胞,Δf最小的具有最佳治疗效果。以U251细胞系为例,ETO处理后频率偏移Δf最小(Δf=15.37),杀伤效果最好。IR处理后LN229频率偏移最小(Δf=26.87),对IR最敏感。流式细胞术和EdU细胞增殖检测结果与ELC-MTMs生物传感器检测结果一致。3.太赫兹ELC-MTMs生物传感器筛选个体胶质瘤最佳治疗方案(1)脑胶质瘤诊疗指南推荐的4种化疗药物及4种靶向治疗药物处理3例原代胶质瘤细胞检测结果提示替莫唑胺对LG-22-19的治疗效果最佳(Δf=6.82);BRAF选择性抑制剂Vemurafenib对LG-22-20的治疗效果最好(Δf=10.7);LG-22-32在IDH1突变体酶抑制剂AG120处理下效果最好(Δf=12.1),其次是顺铂(Δf=12.52)。(2)流式细胞术和EdU细胞增殖检测筛选的最佳治疗方式和太赫兹ELC-MTMs生物传感器检测结果一致。(Cell Isolation3)核对胶质瘤患者测序结果发现,LG-22-20存在BRAF突变,是导致BRAF抑制剂Vemurafenib起效的主要原因;基于AIGS的术中快速分子检测及术后NGS均提示LG-22-32患者存在IDH1 R132H突变,是IDH1突变体酶抑制剂AG120起效的主要原因。结论:(1)提出了一种无标记、快速、非破坏性的活细胞检测新方法,自主研发的太赫兹ELC-MTMs生物传感器能够实时监测辅助治疗处理下胶质瘤的细胞数量和活性状态,具有评估辅助治疗敏感性,指导脑胶质瘤个体化治疗的潜力。(2)相较于传统的生物学检测方法,自主研发的太赫兹ELC-MTMs生物传感器检测时间短,每次仅需5分钟,仅仅为流式细胞术的1/24,EdU细胞增殖实验的1/60,Δf综合性指标易解读,临床应用便捷高效。(3)传统生物学实验和患者来源的原代胶质瘤细胞检测结果证实:自主研发的太赫兹ELC-MTMs生物传感器筛选个体胶质瘤最佳治疗方案具有较高的准确性。