心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)是全球发病率和死亡率较高的主要疾病之一。血管重塑(Vascular remodeling,VR)是动脉粥样硬化、高血压和经皮冠状动脉介入手术后再狭窄等血管疾病的常见病理形式。血小板在血管重塑过程中发挥着重要作用,血管内膜损伤后,循环血小板在损伤的内膜上粘附和聚集,导致血栓形成。活化的血小板还可以释放炎症因子和血小板衍生微粒(Platelet microparticles,PMPs),诱导VSMCs增殖和迁移,促进细胞外基质合成,加剧血管重塑过程。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)过度增殖、迁移及表型转化造成的内膜增生是病理性血管重塑过程的中心环节。因此,阐明血管重塑的机制,寻求新的治疗药物是治疗血管重塑的关键。微小RNAs(microRNA,miRNA)是由19～25个核苷酸构成的单链非编码小RNA,它们通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合,促进mRNA降解或阻断蛋白翻译,从而调控机体病理生理过程。最新研究发现,miRNAs在血管重塑中发挥重要作用,可成为血管重塑治疗干预的新靶点。迷迭香酸(Rosmarinic aeffective medium approximationcid,RA)是一种广泛存在于植物界的酚酸类化合物,具有强大的抗氧化、抗炎和免疫调节等药理作用,随着对RA研究不断深入,其对CVD的治疗作用已成为研究热点。本研究旨在探讨RA对血管重塑过程中血小板功能和新生内膜增生的作用,并探究可能的分子机制和相关信号通路,以期为治疗血管重塑提供新的药物和作用靶点。本研究分为三部分:(1)RA抑制血小板功能和血管重塑的作用及机制研究通过大鼠颈动脉球囊损伤构建新生内膜增生模型,HE染色发现,Mod组内膜增生,中膜增厚,管壁局限性隆起,内膜和中膜面积显著增加,管腔面积减少,内膜/中膜面积比值增加,提示新生内膜增生模型构建成功;RA各干预组有效地抑制内膜增生,降低内膜、中膜面积,增加管腔面积,降低内膜/中膜面积比值。为探究RA对大鼠新生内膜增生模型中血小板功能的作用,通过血小板聚集仪、流式细胞术和Elisa法检测发现,RA各干预组和Clp组可以显著降低血小板聚集率、血小板内Ca~(2+)含量、血小板衍生微粒的分泌和血小板衍生微粒CD61~+CD62P~+蛋白表达,下调TXA2、ET-1、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β因子和上调PGI2因子的表达。说明RA和Clp有效地抑制了血小板的功能,减轻血管损伤和血管内的炎症反应。为探究RA对大鼠新生内膜增生的作用,通过Masson染色发现RA各干预组和Clp组可以减轻胶原纤维沉积。通过Western blot实验发现,RA各干预组可以显著升高收缩标志物α-SMA、SM22α和SMMHC蛋白表达,降低合成标志物OPN蛋白表达;而Clp组仅升高α-SMA蛋白表达,降低OPN蛋白表达。本研究还发现,RA各干预组可升高细胞核Nrf2蛋白表达,降低而细胞质Nrf2和Keap1蛋白表达,升高通路相关蛋白HO-1、NQO1、GCLM和GST表达;而Clp组仅降低细胞质Nrf2蛋白表达,升高HO-1和GST蛋白表达。为探究RA对VSMCs细胞的作用,通过MTT实验发现20ng/mL PDGF-BB诱导VSMCs细胞增殖能力显著增强;RA在0～400μM对VSMCs细胞无毒性作用,并且RA各干预组(25μM、50μM和100μΜ)可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖反应。EdU检测发现,RA各干预组EdU表达阳性率显著降低。流式细胞术检测RA各干预组明显增加VSMCs细胞G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例,抑制VSMCs细胞增殖反应。通过划痕和Transwell实验发现,RA各干预组抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞迁移反应。通过Western blot实验发现,RA各干预组可抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞收缩标志物α-SMA、SM22α和SMMHC蛋白表达降低及合成标志物OPN蛋白表达升高。为进一步研究RA的作用机制,通过Western blot实验检测Nrf2/ARE信号通路蛋白表达,发现RA各干预组可显著升高VSMCs细胞核Nrf2蛋白表达,而降低细胞质Nrf2和Keap1蛋白表达,同时升高Nrf2信号通路相关蛋白HO-1、NQO1、GCLM和GST表达;说明RA可激活Nrf2/ARE信号通路减轻VSMCs氧化应激损伤。(2)RA通过调节miR-25-3p/SIRT6/Nrf2/ARE信号通路抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和表型转化从GEO数据库下载GSE152078数据集,筛选得到在血小板衍生微粒中表达水平高且保守性好的10个miRNAs。通过RT-qPCR验证发现,miR-25-3p在内膜损伤模型的血小板衍生微粒及PDGF-BB诱导的VSMCs细胞中表达https://www.selleck.cn/products/ms-275.html显著升高,而RA组显著抑制了miR-25-3p的表达。通过数据库预测发现miR-25-3p与SIRT6mRNA的3′-UTR存在结合位点,验证发现PDGF-BB诱导的VSMCs中SIRT6mRNA和蛋白表达显著降低,而RA可升高SIRT6 mRNA和蛋白的表达。查阅文献可知SIRT6已被证实是Nrf2/ARE信号通路正向调节因子,第1章中已经证实RA可激活Nrf2/ARE信号通路减轻氧化应激损伤,所以推测RA可能通过调节miR-25-3p/SIRT6/Nrf2/ARE信号通路发挥对新生内膜增生和VSMCs细胞的作用。为探究miR-25-3p的生物学功能,通过EdU、划痕、Transwell及Western blot实验发现,miR-25-3p mimics可促进PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和表型转化,而miR-25-3p inhibitor发挥相反的作用。为了进一步研究miR-25-3p是否介导了RA对VSMCs细胞的保护作用,在VSMCs给予RA的同时转染miR-25-3p mimics,发现miR-25-3p mimics可部分阻断RA抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和表型转化的作用。为了进一步探究miR-25-3p调控VSMCs细胞的机制,通过双荧光素酶报告基因实验证实,miR-25-3p与SIRT6存在1个结合位点。VSMCs细胞转染miR-25-3p mimics后,可下调SIRT6 mRNA和蛋白表达,而miR-25-3p inhibitor发挥相反的作用。证明miR-25-3p能够靶向并调控SIRT6的表达。为了进一步证实miR-25-3p可通过靶向SIRT6调节VSMCs细胞的生物学功能,本研究通过挽救实验发现,si-SIRT6部分阻断了miR-25-3p inhibitor抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移、表型转化和激活Nrf2/ARE信号通路的作用。(3)miR-25-3p介导RA抑制血管重塑的作用本章实验采用C57BL/6J小鼠颈总动脉结扎构建新生内膜增生模型。C57BL/6J小鼠颈总动脉结扎手术28天后,HE染色发现Mod组管腔狭窄,血管内膜显著增生,内膜和中膜面积显著增加,内膜/中膜面积比值显著增加,提示小鼠颈总动脉结扎模拟新生内膜增生模型构建成功。HE和Masson染色结果显示RA干预组能有效地抑制新生内膜增生和胶原纤维沉积;而miR-25-3p agomir可以部分阻断RA抑制新生内膜增生的作用。通过RT-qPCR、Western blot及免疫荧光染色实验发现,RA可下调miR-25-3p表达,升高SIRT6表达,升高收缩标志物α-SMA、SM22α、SMMHC蛋白表达,降低合成标志物OPN蛋白表达,而miR-25-3p agomir可以部分阻断RA的上述作用。通过Western blot实验发现,RA可升高细胞核Nrf2蛋白和通路相关蛋白HO-1、NQO1、GCLM和GST表达,降低细胞质Nrf2和Keap1蛋白表达,而miR-25-3p agomir可以部分阻断RA激活Nrf2/ARE信号通路的作用。综上所述,本研究从动物、细胞和分子水平探究RA对血管重塑的作用及其机制,所得结论如下:1.RA通过抑制颈动脉损伤后血小板聚集和血小板衍生微粒分泌,降低血小板内Ca~(2+)含量,下调TXA2、ET-1、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β因子和上调PGPUN30119分子量I2因子的表达,从而抑制血小板的功能及血管重塑。2.体内外研究证实,RA抑制颈动脉损伤后新生内膜增生及PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和表型转化,激活Nrf2/ARE信号通路减轻氧化应激损伤,抑制血管重塑。3.体外研究证实,RA可能通过调节miR-25-3p/SIRT6/Nrf2/ARE信号通路抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞增殖、迁移和表型转化。4.体内研究证实,miR-25-3p可以介导RA抑制血管重塑的作用,说明miR-25-3p可能是RA抑制血管重塑的重要分子靶点。