研究目的:粘膜相关恒定T(mucosal-associated invariant T,MAIT)细胞为非常规的固有免疫T淋巴细胞,主要富集在粘膜和肝脏组织中,具有抗菌、抗病毒、组织修复等功能。MAIT细胞主要识别MHC-Ⅰ类分子相关蛋白1(MHC class I-related molecule 1,MR1)提呈的抗原。虽然已知MAIT细胞能识别细菌来源的核黄素途径维生素B类代谢产物,Child psychopathology但其能识别的抗原大部分仍然是未知的。本研究旨在构建一种基于MR1能在体外提呈抗原给MAIT细胞的人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presenting cell,a APC),以期能探究影响MAIT细胞活化的物质。前期实验室研究发现直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)能影响MAIT细胞的功能,并且这种作用具有DBIL浓度依赖性。本研究将进行关于DBIL在肝脏疾病中是否通过影响免疫细胞的功能来selleckchem MCC950控制疾病的进展,以及具体影响机制的研究,为临床肝病的治疗提供免疫方向治疗参考。研究内容:构建一种能探究MAIT细胞识别的抗原物质的基于MR1的二聚体(MR1dimer),并制成MR1依赖的人工抗原提呈细胞(MR1 a APC)以进行下一步对不同抗原物质激活MAIT细胞效应的研究。关于DBIL影响MAIT细胞的机制,主要从2个方向进行研究:1.DBIL对MAIT细胞的影响是否具有TCR依赖性;2.从基因表达水平探究DBIL影响MAIT细胞的机制。研究方法:1.利用DNA拼接技术,将人的MR1胞外段基因与Ig G1的Fc段基因拼接成一段完整的基因序列MR1-Fc,再将MR1-Fc与人的β2m基因插入到载体p Fast Bac ~(TM)Dual中,利用Bac-to-Bac系统构建表达MR1二聚体。将MR1二聚体制成基于MR1的人工抗原提呈细胞(MR1PS-341化学结构 a APC)。运用MR1 a APC研究大肠杆菌来源的代谢物是否具有激活MAIT细胞的功能。2.DBIL对MAIT细胞的影响是否具有TCR依赖性:将健康人外周血单个核细胞(PBMC)在TCR依赖以及非TCR依赖的刺激体系中共培养7天后检测MAIT细胞的增殖受DBIL的影响是否有差异。将DBIL与构建的MR1 a APC共孵育,检测DBIL是否能与MR1结合。3.从基因表达水平探究DBIL影响MAIT细胞的机制:扩增健康个体人PBMC中的MAIT细胞,将扩增的MAIT细胞在TCR依赖的刺激体系(CD3/CD28,5-OP-RU/MR1 a APC)以及非TCR依赖的刺激体系(IL-12/IL-18)中共培养24 h,提取MAIT细胞中的RNA进行转录组测序,探究MAIT细胞在3种不同刺激体系中受DBIL影响后基因水平的改变。研究成果:在体外成功构建了MR1二聚体,并检测了MR1二聚体的产量,分子大小等。成功构建了MR1 a APC,加载了大肠杆菌代谢物的MR1 a APC与健康人PBMC在体外共培养,1天的培养结果显示,大肠杆菌的代谢产物能一定程度的激活MAIT细胞,虽然较5-OP-RU/MR1 a APC弱。7天的培养结果显示,大肠杆菌的代谢产物能使MAIT细胞增殖,也较5-OP-RU/MR1 a APC弱。接下来用弱盐酸洗脱MR1 a APC上结合的代谢物后进行质谱检测筛选出MAIT细胞可识别的抗原物质。此外,DBIL与MAIT细胞共培养后的转录组数据显示DBIL影响了MAIT细胞的抗原提呈以及铁死亡相关通路。研究结论:在体外成功构建了MR1二聚体并制成了MR1 a APC,可利用MR1 a APC探究激活MAIT细胞的抗原物质,DBIL可能通过影响MAIT细胞的抗原提呈以及铁死亡相关通路发挥其调节作用。