骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨量减少,骨组织微结构恶化为特征的代谢性骨病。骨质疏松症多发于老年人群,尤其是绝经后妇女。绝经后妇女雌激素水平下降,导致骨转换增加,骨形成和骨吸收失衡,最终导致骨质流失加快。目前临床上可用于骨质疏松预防和治疗的药物种类繁多,Bioglass nanoparticles但这些药物治疗存在众多缺点。因此,迫切需要具有良好安全性的替代疗法来增加骨量和预防骨折。骨碎补总黄酮(Total flavonoids of Rhizoma Drynariae,TFRD)是临床上治疗骨质疏松的中成药,但在临床上TFRD多与其他药物联合使用治疗骨质疏松的效果更佳。二甲双胍(Metformin,Met)作为治疗2型糖尿病药物,具有较高的安全性和有效性,并且Met在治疗糖尿病性骨质疏松方面发挥出巨大潜力。因此,我们选择Met和TFRD联用,观察Met联合TFRD的抗骨质疏松作用及其机制。首先,我们基于转录组学和磷酸化蛋白质组学分析Met和TFRD调控骨细胞的潜在机制。转录组学和磷酸化蛋白质组学结果表明,Met和TFRD均可以影响骨细胞中钙信号通路、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)-蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/AKT)信号通路、Wnt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路和破骨细胞分化信号通路等。基于前期实验研究和文献检索,我们推测在骨细胞调控成骨方面,Met和TFRD可能作用于Wnt/β-catenin信号通路发挥刺激成骨作用;在骨细胞调控破骨方面,Met和TFRD可能作用于破骨细胞分化通路抑制破骨作用。随后,我们将采用一系列体内外实验验证Met和TFRD的抗骨质疏松作用及其机制。体外实验我们以骨组织中主要类型的细胞为研究对象,即成骨细胞祖细胞(BMSCs)、成骨RP56976说明书前体细胞(MC3T3-E1)、骨细胞(IDG-SW3)和破骨细胞(RAW264.7)。通过MTT法确定Met和TFRD刺激骨细胞,抑制破骨细胞的最适浓度分别为0.1 m M和1 mg/L。随后通过划痕实验、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、矿化结节染色、免疫荧光实验、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色、骨吸收陷窝实验和蛋白质印迹实验,观察Met联合TFRD对不同分化阶段的成骨和破骨细胞分化的影响。体外实验结果表明,Met联合TFRD可以显著促进成骨细胞祖细胞的迁移,刺激成骨前体细胞的分化和成熟。此外,Met联合TFRD可显著抑制骨细胞中成骨抑制剂硬化蛋白(Sclerostin,SOST)和Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-1,DKK1)的表达,Met联合TFRD也显著下调了核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)/骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)比例。在破骨细胞方面,Met联合TFRD显著抑制了破骨细胞的分化和骨吸收功能。我们的研究结果表明,Met联合TFRD能够促进成骨细胞分化,抑制破骨细胞功能,且Met联合TFRD作用效果要强于单独的TFRD作用。为了进一步评价Met联合TFRD体内抗骨质疏松作用及其机制,我们通过去卵巢(Ovariectomy,OVX)手术,成功复制了骨质疏松大鼠模型。通过灌胃给予骨质疏松大鼠1 mg·kg~(-1)·day~(-1)阳性药雷洛昔芬(Raloxifene,RLX)、100 mg·kg~(-1)·day~(-1) Met、72 mg·kg~(-1)·day~(-1) TFRD以及100 mg·kg~(-1)·day~(-1) Met+72 mg·kg~(-1)·day~(-1) TFRD。灌胃10周后麻醉处死,收集大鼠血清,长骨及心肝肾脑等器官。实验中检测了大鼠血清生化指标,并通过Micro CT、三点弯曲试验、HE染色、免疫组化染色和蛋白质印迹实验观察Met联合TFRD抗骨质疏松作用及其机制。体内实验结果表明,在Met没有降低骨质疏松大鼠血糖的前提下,Met联合TFRD对骨质疏松大鼠无显著肝肾毒性,但显著降低骨质疏松大鼠血清中I型胶原交联C端肽(Type-I collagen carboxy-terminal peptide,CTX-1)和TRAP等骨吸收标志物水平,并显著提高骨形成标志物I型胶原N端前肽(Propeptide of type I procollagen,PINP)水平。另外,Met联合TFRD可改善骨质疏松大鼠的骨密度(Bone mineral density,BMD)和骨微观结构,增强其力学性能。在分子水平上,一方面,Met联合TFRD降低了骨质疏松大鼠骨组织中SOST和DKK1蛋白表达,刺激Wnt10b和β-catenin蛋白表达,抑制糖原合成激酶3β(GlycPevonedistat体外ogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)磷酸化,并上调ALP和Runx2蛋白表达。另一方面,Met联合TFRD降低了骨质疏松大鼠骨组织中RANKL/OPG比例,抑制核因子κB受体活化因子(Receptor activator of nuclear factor-kappa B,RANK)及其下游活化T细胞的核因子c1(Nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)和TRAP蛋白表达。以上结果表明,Met联合TFRD处理能够提高骨质疏松大鼠骨质量和骨强度,且优于单独TFRD给药,并验证Met联合TFRD可激活Wnt/β-catenin信号通路刺激骨形成,而降低RANKL/OPG比例抑制骨吸收。综上所述,本研究阐明了Met联合TFRD抗骨质疏松作用及其机制。在细胞水平上,Met联合TFRD处理在刺激成骨细胞祖细胞和成骨前体细胞分化、抑制破骨细胞生成和骨吸收功能方面的作用效果要强于单独TFRD作用。体内实验表明Met联合TFRD在提高骨质疏松大鼠骨质量、生物力学性能方面也强于单独TFRD作用。我们证明了骨细胞来源的成骨抑制因子SOST和DKK1、破骨转录因子RANKL和OPG在调控成骨和破骨信号通路中发挥着重要作用。体内和体外实验结果证实了Met联合TFRD抗骨质疏松具有良好的作用效果。