结构复杂的天然产物是现代药物研发的重要源泉,在农业和医药应用中发挥着重要作用。对天然产物生物合成途径的解析,特别是对合成途径中关键酶的解析,不仅可以发现催化复杂反应的新型酶,作为合成生物学底盘元件应用于微生物细胞工厂,还可以用于构建仿生途径从而实现活性天然产物及其衍生物的异源高效合成。本论文针对课题组前期在植物内生真菌Cercospora sp.JNU001首次发现的复杂蒽醌类天然产物贝第高林(beticolin)的生物合成基因簇(BTG),对其生物合成过程中关键酶的催化机制进行研究,实现了贝第高林生物合成途径的解析,并对其中部分关键酶进行理性改造,实现了药物中间体手性醇的合成。具体研究结果如下:1.解析了贝第高林生物合成过程中蒽酚还原酶BTG9催化大黄素还原的机制首先,对贝第高林生物合成途径中的蒽酚还原酶BTG9的催化特性进行研究,表明BTG9可以在无氧条件下高效地将大黄素对苯二酚还原为(R)-3,8,9,10-tetrahydroxy-6-methyl-3,4-dihydroanthracene-1(2H)-one(2),产物ee值大于99%,K_m值和k_(cat)值分别为0.2 m M和102.51 min~(-1)。此外,BTG9对雌酮(3a)及其类似物也表现出一定的催化活性。随后,为了揭示其催化机理,解析了BTG9-NADP~+和BTG9-NADP~+-大黄素的复合物晶体结构,发现处于氨基酸序列中的209-216柔性loop区域在底物识别和结合中发挥重要作用,其中的氨基酸残基Tyr210通过与His162形成氢键相互作用从而识别、结合和稳定底物,确保底物能够以催化构象稳定结合在BTG9的结合口袋中而获得单一手性的产物。2.基于BTG9的蛋白结构进行理性改造,实现了光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮和β-卤代醇的合成为了进一步挖掘BTG9的催化能力,以实现复杂药物中间体光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮和β-卤代醇的合成,首先以2-methyl-2-(4-methylbenzyl)cyclopentane-1,3-dione(5a)为模式底物,开展基于BTG9蛋白结构的理性改造。实验表明通过突变Tyr210和His162而破坏潜在的氢键作用的bio-templated synthesis三种突变体(BTG9-H162F、BTG9-Y210A和BTG9-Y210F),都能够催化底物5a合成光学纯的2,2-二取代-3-羟基环酮产物。相较于野生型,三种突变体均对底物5a的催化活性明显提升,其中最优突变体BTG9-H162F的催化效率是野生型的45倍。随后,对突变体BTG9-H162F的应用潜力进行进一步拓展,发现突变体BTG9-H162F不仅有效地将多种2,2-二取代-1,3-环二酮还原为光学纯2,2-二取代-3-羟基环酮(dr>99/1,ee>99%),而且也能将α-卤代苯乙酮转化为光学纯的β-卤代醇(ee>99%)。为了解释突变体BTG9-H162F催化2,2-二取代-1,3-环二酮和α-卤代苯乙酮获得相应光学纯产物的机理,分别解析了突变体BTG9-H162F-NADP~+-5a和BTG9-H162F-NADP~+-2-bromo-1-(4-bromo-2-hydroxyphenyl)ethan-1-one(6e)的复合物晶体结构,阐明了各自的立体选择性机制,这些研究结果为其它蒽酚还原酶催化机理研究和分子改造提供了基础。3.发现了一种新型非血红素铁依赖型金属酶BTG13,并解析其催化贝第高林生物合成过程中蒽醌环裂解的机制为了解析贝第高林生物合成过程中大黄酚蒽醌环裂解机制,通过生物信息学分析和体外实验,确认了来源于Cercospora sp.JNU001的BTG13是一种Questin氧化酶,参与催化大黄酚蒽醌环的裂解。为了揭示BTG13催化大黄酚蒽醌环断裂的机理,利用单Ipatasertib波长反常散射法解析并获得了BTG13的晶体结构。通过电子密度图分析,发现BTG13的活性中心由His55、His158、His296、His374、潜在修饰的Lys377和水分子配位一个金属离子构成。为了确定金属离子种类,首先利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对纯化的BTG13进行分析,发现Fe~(2+)的比重最大,初步确定配位的金属离子为Fe~(2+);随后利用螯合剂EDTA对纯化的BTG13进行处理,通过不同金属离子的回补,结合生化实验,确定配位的金属离子为Fe~(2+)。随后,通过电子云密度图的构象分析和体外生化验证,确认活性中心的Lys377通过羧化反应形成羧化赖氨酸(Kcx377)参与配位。以上结果阐明了BTG13是一种尚未报道的新型非血红素铁依赖型金属酶。随后,通过晶体结构分析和突变验证,发现Thr299和His58会与Kcx377形成氢键作用,对BTG13的催化活性起到调节作用。最后,为了研究BTG13的底物识别机制,利用分子对接获得了BTG13与底物结合的模型,并通过突变体活性验证发现Arg48、His53、Phe292以及His181在BTG13的底IACS-10759溶解度物识别和结合中起关键作用,其中His53与底物反应位点的距离最近,可作为质子受体直接参与催化反应,并基于上述结果提出了BTG13催化蒽醌环裂解的酶促反应机制。