脊髓损伤是由直接或间接因素导致的脊髓组织结构破坏和神经功能障碍。脊髓损伤导致大量神经元轴突断裂,被破坏丢失的神经元无法再生,损伤区由神经胶质细胞和成纤维细胞进行修补后形成胶质瘢痕。损伤早期,胶质瘢痕包裹在损伤组织周围与外界隔离,保护正常组织,限制了损伤的扩散;构成瘢痕的胶质细胞释放大量神经营养因子,如神经生长因子等,来保护神经元及促进轴突再生。然而,随着胶质瘢痕的成熟,其空间结构逐渐致密,成为阻碍轴突延长的物理屏障;同时,瘢痕组织中的胶质细胞、成纤维细胞及免疫细胞会释放大量的抑制性因子抑制神经元再生及轴突伸长,随着时间的延长,这些抑制性因子在瘢痕组织基质中不断沉积,形成化学屏障。胶质瘢痕的形成最终阻断了损伤组织中上、下行神经纤维的信号传递,是脊髓损伤后神经再生困难的重要因素。胶质瘢痕的形成对于脊髓损伤后的神经元及轴突再生在不同时间段内发挥着不同的作用,然而其具体的作用时间、作用机制及调控因素仍需进一步探索。本研究通过探索胶质瘢痕形成过程中的组织学和病理生理学变化规律,寻找如何有效地掌控胶质瘢痕使其发挥有利作用的方法,并应用于脊髓损伤的治疗。研究主要分为两个阶段,第一阶段通过研究脊髓损伤后不同时间的胶质瘢痕形成特点及对损伤后功能修复的影响,找到能够发挥胶质瘢痕有利作用的时间点并深入解析其促进作用发生机制;第二阶段分析瘢痕切除后促进损伤功能恢复的作用机制,并发现微管稳定剂紫杉醇是治疗脊髓损伤的潜在药物,通过体外和体内研究证实紫杉醇可以促进脊髓损伤区βⅢ-tubulin的表达,从而促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。第一阶段:在这一阶段,首先建立了符合研究需要的大鼠T8-T9脊髓全横断损伤模型,通过行为学BBB评分、皮层诱发电生理、组织学和病理生理学方法,在损伤后的各个阶段筛选出与运动功能恢复相关的关键时间点。研究结果发现,脊髓损伤后的第5天,损伤区可见透明胶质瘢痕形成;损伤7天以后,大量Nestin和GFAP共染阳性细胞出现,Nestin染色阳性细胞向瘢痕组织中央迁移,并在损伤后的10-15天内细胞数量达最大值。损伤后15-30天,损伤区的病理生理活动已趋于平稳,组织解剖可见结构紧密、韧性较强的透明成熟胶质瘢痕形成。行为学BBB评分在损伤后的45-60天陆续达到7分后进入平台期,损伤后的第45和60天是行为学变化较为关键的时间节点。综合分析,脊髓损伤后的第5、7、10、15、30、45、60天是瘢痕组织形成过程中影响功能恢复的重要时间节点。接下来,将大鼠T8-T9脊髓全横断损伤模型按照损伤后第5、7、10、15、30、45、60天这7个时间节点随机分组,各组在对应的时间点切除瘢痕组织后持续饲养至损伤后第120天;选择未切除瘢痕的T8-T9脊髓全横断损伤大鼠作为对照组。期间采集各组大鼠的行为学BBB评分、皮层诱发电生理和组织学染色数据。结果发现,切除瘢痕组织后的大鼠运动功能逐渐出现恢复,且再次形成的瘢痕组织中可见有神经元出现,βⅢ-tubulin的表达量增高。尤其在损伤后第7、10、15天切除瘢痕组织后大鼠的运动功能恢复最为显著,免疫荧光染色可见长轴突神经元贯穿于新生瘢痕组织中,在损伤断端间形成新的连接,βⅢ-tubulin表达量显著增高。利用转录组测序技术对损伤后第7、10、15天这三个时间点所对应的瘢痕切除前后的组织进行差异基因分析后发现,该运动功能的恢复涉及到PI3K-Akt等多个信号通路的共同调控而发生的,主要通过调控免疫、促进神经发育、稳定内环境、减少细胞凋亡等方式为神经元及轴突再生提供了有利条件;而瘢痕切除后引起的βⅢ-tubulin表达量增高,是促进运动功能恢复的关键,与基因Tubb3上调和Tubb6下调相关。Tubb3基因可编码βⅢ-tubulin,是神经元骨架和纺锤体的主要成分蛋白,在神经干细胞向神经元的分化过程中不断聚合和解聚,影响神经元的分化以及轴突生长。Tubb6基因编码的βⅥ-tubulin在微管蛋白亚型中性质较为独特,Tubb6基因的过度表达会破坏细胞内的微管结构,导致细胞内微管稳定性降低,相反,Tubb6基因下调可以促进微管稳定。这提示我selleck PD-0332991们微管的稳定性在维持内环境稳态和促进神经元及轴突再生中具有重要作用。第二阶段:根据第一阶段的研究结果发现,微管的稳定性加强是促进脊髓损伤后神经元及轴突再生以及运动功能恢复的重要因素。微管稳定剂紫杉醇是首个被发现作用于真核细胞微管系统促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。低浓度紫杉醇可以调低微管动力性来稳定微管,高浓度则促进微管发生聚合。文献报道,紫杉醇既可以通过与β微管蛋白结合,上调Tubb3基因的表达,又可以通过降低胞内Tubb6基因的表达来稳定微管。因此推测紫杉醇可能对脊髓损伤治疗有效,并通过体外和体内两条途径进行了验证。体外实验采用出生24小时以内的SD大鼠乳鼠大脑来源的神经干细胞,经过一段时间的体外培养和增殖后,在其分化阶段应用不同浓度的紫杉醇进行干预。结果显示,低剂量紫杉醇(<7 nmol/L)可以诱导体外培养的脑源神经干细胞向神经元分化并且可以促进神经干细胞来源的神经元轴突伸长;适宜浓度区间(3.5-5 nmol/L)的紫杉醇可以促进神经干细胞向神经元分化的同时提高神经干细胞来源的神经元成熟度,且分化所得均为长轴突的多极神经元;而较高浓度(>10nmol/L)的紫杉醇对神经细胞则表现出显著的细胞毒作用。因此,体外实验表明当紫杉醇位于适宜浓度区间3.5-5 nmol/L时可以促进神经干细胞向神经元分化并有效促进其轴突伸长。体内实验采用大鼠T8-T9脊髓全横断损伤模型,我们在损伤后立即将纤维蛋白凝胶包裹紫杉醇白蛋白纳米微球移植入损伤缺损区。该生物材料可以使恒定剂量的紫杉醇在损伤区缓慢的持续释放达30天,同时生物材料也在30天后被机体彻底吸收。结果显示,剂量为0.05-0.5μg/只的低剂量紫杉醇可以使急性脊髓损伤大鼠损伤区组织中βⅢ-tubulin的表达量增高,促进损伤区神经元再生及轴突伸长,并改善脊髓损伤大鼠的运动功能。综上所述,本课题分析了脊髓损伤后不同时间点的瘢痕组织对神经元再生及功能修复的影响。提出脊髓损伤后第5、7、10、15、30、45、60天是功能恢复的重要时间点,而且损伤后第2周的变化过程对功能恢复的影响最大。在脊髓损伤后的第2周将瘢痕组织切除后,损伤组织中Tubb3基因上调和Tubb6基因下调促进微管稳定并引起βⅢ-tubulin的表达量增高,促进了神经元及轴突再生,是脊髓损伤治疗的关键时间窗。同时我们还发现,微管稳定剂紫杉醇可以与β微管蛋白结合,上调Tubb3基因促进βⅢ-tubulin表达,下调Tubb6基因使细胞内微管稳定;经体外实验发现,3.5lower urinary tract infection-5 nmol/L浓度的紫杉醇诱导体外培养的脑源神经干细胞向多极神经元分化,并促进轴突伸长;体内实验证实剂量为0.05-0.5μg/S63845供应商只的低剂量紫杉醇,可以促进脊髓损伤大鼠损伤区组织中神经元再生及其轴突伸长,显著促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。从而证实紫杉醇具有治疗脊髓损伤的功效,并完成了体外和体内应用的药物剂量和效应关系的验证,揭示新的药理作用,为紫杉醇用于脊髓损伤治疗这一新功效的开发提供参考,加速“老药新用”进程。