目的1.研究姜黄素对肺癌A549细胞增殖、侵袭、凋亡的影响,并初步探究其作用机制。2.研究黄芪甲苷对肺癌A549细胞增殖的作用,并初步探究其机制。研究方法与内容本课题研究主要分为两部分。第一部分:姜黄素在体外对肺癌A549细胞的作用及机制研究。1.体外培养A549细胞,至细胞处于对数生长期时,依次加入含0、10、20、40、80、160μmol/L姜黄素的完全培养基,干预24 h及48 h,应用CCK-8法检测细胞增殖情况,筛选出姜黄素用药适当的作用浓度及时间。2.将实验Naporafenib作用分为5组:阴性对照组(仅有细胞培养液)、姜黄素低浓度组(10μmol/L),姜黄素中浓度组(20μmol/L),姜黄素高浓度组(30μmol/L)和阳性对照顺铂组(4μg/m L),分别作用24 h、48 h,应用流式细胞术Annexin V/PI双染法,检测各组细胞的凋亡情况,统计凋亡和坏死细胞占全部细胞的比率。3.再次将实验分为4组:阴性对照组(仅有细胞培养液)、姜黄素低浓度组(10μmol/L)、姜黄素中浓度组(20μmol/L)、姜黄素高浓度组(30μmol/L),运用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化。4.按上述分组,采用Western blot法检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphorylated-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT、PKB),以及凋亡相关蛋白:Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-Associated X,Bax)、胱天蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、胱天蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9,Caspase-9)的表达水平,解析姜黄素抑制肺癌细胞增殖、侵袭,促进凋亡的可能机制。第二部分:黄芪甲苷在体外对肺癌A549细胞的作用及机制研究。1.在体外培养非小细胞肺癌细胞A549细胞,传代培养,待细胞处于对数生长期时,依次加入含0、50、100、200、400、800μmol/L黄芪甲苷的完全培养基,进行药物干预48 h,应用CCK-8法检测细胞增殖情况,并筛选出黄芪甲苷适当的浓度。2.实验分为4组:阴性对照组(仅有细胞培养液)、黄芪甲苷低浓度组(100μmol/L)、黄芪甲苷中浓度组(200μmol/L)、黄芪甲苷高浓度组(400μmol/L)组,采用Western blot法检测p-PI3K、PI3K、磷酸化的蛋白激酶B(Phosphorylated-protein kinase B,p-AKT)、AKT蛋白的表达。3.按上述分组,运用RT-q PCR检测黄芪甲苷对肺癌A549细胞AKT、E-型钙黏蛋白(E-cadherin、CDH1)、肿瘤蛋白53(Tumor Protein P53,TP53)基因表达的影响。解析黄芪甲苷抑制肺癌细胞增殖的可能机制。研究结果第一部分:1.CCK-8实验显示:姜黄素能抑制肺癌A549细胞的增殖,呈浓度依赖性。与姜黄素0μmol/L组相比,其余各浓度姜黄素干预24 h和48 h,细胞增殖率差异均具有统计学意义(P<0.0001)。姜黄素处理A549细胞48 h,IC_(50)为17.59μmol/L。2.流式细胞术检测显示:与阴性对照组相比,各姜黄素处理组坏死、凋亡细胞的比例增加,呈剂量、时间依赖性。经药物处理24 h后,姜黄素高浓度组和阴性对照组相比,细胞凋亡率提高,差异具有统计学意义(P<0.001);阳性对照顺铂组和阴性对照组相比,细胞凋亡率提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。经药物处理48 h后,和阴性对照组相比,各药物组细胞凋亡率均提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.Transwell实验显示:姜黄素以浓度依赖的方式抑制A549细胞的侵袭能力,各浓度组与阴性对照组相比均具有统计学意义(P<0.001)。4.Western blot实验显示:与阴性对照组比,姜黄素处理能降低A549细胞的p-PI3K蛋白表达,中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);姜黄素降低细胞中的PI3K蛋白表达,其中姜黄素高剂量组与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.0001);AKT蛋白表达提高,与阴性对照组相比,姜黄素中、低浓度组差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。各组细胞中的p-PI3K/PI3K蛋白相对表达量比值无明显趋势。与阴性对照组相比,姜黄素各组Bax表达提高,中、低浓度组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);姜黄素各组Caspase-3表达升高,与阴性对照组相比,高浓度组差异具有统计学意义(P<0.05);姜黄素各组Caspase-9蛋白表达差异不明显,没Ipatasertib生产商有统计学意义(P=0.6169)。第二部分:1.CCK-8实验显示:黄芪甲苷能抑制肺癌A549细胞biomarker risk-management的增殖,呈浓度依赖性。不同浓度黄芪甲苷处理肺癌细胞24 h,细胞的增殖抑制率逐渐提高,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。黄芪甲苷处理A549细胞48 h,IC_(50)为106.7μmol/L。2.Western blot实验显示:黄芪甲苷处理可降低细胞中的p-PI3K/PI3K蛋白相对表达量的比值,与阴性对照组比,高浓度组差异有统计学意义(~(**)P<0.01);和阴性对照组比,黄芪甲苷低、中、高浓度组细胞中的p-AKT/AKT蛋白相对表达量的比值降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.q RT-PCR实验显示:与阴性对照组相比,黄芪甲苷可下调细胞AKT基因的表达,差异具有统计学意义(P<0.01);黄芪甲苷可上调A549细胞CDH1基因表达,与阴性对照组相比,中、高浓度组差异有统计学意义(P<0.01,P<0.001);黄芪甲苷上调细胞TP53基因表达,与阴性对照组相比,高浓度组差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.姜黄素具有抑制肺癌A549细胞增殖、减弱侵袭力、促进凋亡的作用,其作用可能与下调PI3K/AKT信号通路有关。2.黄芪甲苷对肺癌A549细胞有抑制增殖作用,其作用可能与抑制PI3K、AKT的磷酸化修饰,下调PI3K/AKT信号通路有关。黄芪甲苷还可能通过上调E-cadherin表达,参与逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的过程。