目的 肿瘤患者产生化疗耐药是导致预后不良和死亡的主要原因,目前对于肿瘤产生化疗药物抵抗的分子机制仍不完全清楚。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是从原发肿瘤病灶或肿瘤转移病灶中脱落并进入到血液循环中的肿瘤细胞,可随血液循环到达远隔部位,并且形成新的肿瘤病灶,在肿瘤的化疗药物DS-3201供应商抵抗、转移和不良预后中起重要作用。CTCs发生上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)生物学过程在肿瘤细胞对化疗药物抵抗中发挥着重要的作用。我们团队前期研究发现,CTCs在血液中有着较高的基础自噬水平,较强的DNA损伤修复能力和较低的凋亡水平,在血液中的存活能力更强;在三阴性乳腺癌耐药机制研究中发现,耐表柔比星EPI-Hs578T细胞的PI3K/AKT/mTOR通路被激活,并且有着更强的DNA损伤修复能力。本实验进一步探究影响CTCs对表柔比星等化疗药物敏感性的机制,以及EMT生物学过程在CTCs化疗药物抵抗中的作用。方法1.原位肿瘤细胞(Primary tumor cells,PTCs)分离与鉴定:小鼠右侧第四对乳腺脂肪垫注射4T1亲本细胞,建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型;采用胶原酶消化法分离PTCs;流式细胞术检测上皮标记物EpCAM阳性率,将分离的PTCs进行乳腺脂肪垫成瘤实验和HE染色对其进行鉴定。2.循环肿瘤细胞(CTCs)提取与鉴定:使用Ficoll密度梯度离心方法从模型小鼠血液中捕获CTCs;流式细胞术检测白细胞标记物CD45和上皮标记物EpCAM阳性率,乳腺脂肪垫成瘤实验和HE染色对所捕获CTCs进行鉴定。3.CTCs类型鉴定:检测上皮-间质转化(EMT)相关指标,流式细胞术检测CTCs上皮标记物EpCAM和间质标记物Vimentin阳性率;蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测CTCs上皮标记物E-cadherin和EpCAM,间质标记物N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达水平;细胞免疫荧光检测CTCs上皮标记物E-cadherin和间质标记物Vimentin表达水平。4.CTCs耐药性检测:MTT法检测PTCs和CTCs对表柔比星和紫杉醇的药物敏感性;RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)检测PTCs和CTCs耐药基因MRP1和LRP表达水平;Western Blot检测PTCs和CTCs耐药蛋白MRP1和LRP表达水平。5.PI3K/AKT/mTOR信号通路检测:Western Blot检测PTCs和CTCs磷酸化AKT和mTOR表达水平。6.AKT抑制剂MK2206作用于PTCs和CTCs后回复性实验:MTT法确定MK2206对PTCs和CTCs的适宜作用Anti-hepatocarcinoma effect浓度;PTCs和CTCs对表柔比星和紫杉醇的药物敏感性。Western Blot检测PTCs和CTCs磷酸化AKT和mTOR表达水平;上皮标记物E-cadherin和EpCAM、间质标记物N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达水平;耐药蛋白LRP和MRP1表达水平。细胞免疫荧光检测两种细胞E-cadherin和Vimentin表达水平。RT-PCR检测两种细胞耐药基因LRP和MRP1表达水平。结果1.成功分离原位肿瘤细胞(PTCs):成功建立4T1乳腺癌原位肿瘤动物模型后,采用胶原酶消化法分离出PTCs;流式细胞术检测显示EpCAM(+)细胞占比为99.2%;分离的细胞注入小鼠乳腺脂肪垫后可成瘤,HE染色确定肿块为肿瘤组织,证实所捕获细胞为PTCs。2.成功提取循环肿瘤细胞(CTCs):Ficoll密度梯度离心法从原位肿瘤模型小鼠血液中捕获细胞;流式细胞术检测显示,EpCAM(+)细胞占比为17.6%,而CD45(+)为0.064%,排除了细胞是白细胞的可能。分离的细胞注入小鼠乳腺脂肪垫后可以成瘤,HE染色确定肿块为肿瘤组织,提示分离的细胞来源于癌细胞,证实所捕获细胞为CTCs。3.分离的CTCs呈现为间质为主表型:流式细胞术检测结果显示,CTCs中EpCAM(-)Vimentin(+)细胞占比为70.3%;Western Blot结果显示,CTCs上皮标记物E-cadherin和EpCAM表达水平低于PTCs,间质标记物N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达水平高于PTCs(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,CTCs上皮标记物E-cadherin表达水平低于于PTCs,间质标记物Vimentin表达水平高于PTCs(P<0.05)。三种方法检测结果均提示提取的CTCs呈现为间质为主表型。4.药物敏感性检测:CTCs对表柔比星和紫杉醇的药物敏感性低于PTCs(P<0.05);CTCs耐药基因LRP和MRP1表达水平高于PTCs(P<0.05);CTCs耐药蛋白LRP和MRP1表达水平高于PTCs(P<0.05)。5.PI3K/AKT/mTOR信号通路检测:CTCs磷酸化AKT和mTOR表达水平高于PTCs(P<0.05)。6.AKT抑制剂MK2206作用CTCs后,磷酸化AKT和mTOR表达水平降低(P<0.05);Western Blot检测,上皮标记物E-cadherin和EpCAM表达增高,间质标记物N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达降低(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示E-cadherin表达水平增高,Vimentin表达水平降低(P<0.05);耐药蛋白LRP和MRP1表达水平降低(P<0.05);耐药基因LRP和MRP1表达水平降低(P<0.05);CTCs对化疗药物的敏感性增高(P<0.05)。结论1.从4T1乳腺癌原位肿瘤模型小鼠血液中成功分离出4T1CX-5461核磁循环肿瘤细胞,并鉴定细胞为具有EMT表型特征的间质为主型;2.间质为主型4T1循环肿瘤细胞对化疗药物表柔比星和紫杉醇的敏感性降低;3.4T1循环肿瘤细胞产生的耐药性与PI3K/AKT/mTOR信号通路激活后介导的EMT生物学行为有关。