马铃薯早疫病是由茄链格孢(Alternaria solani)引起的世界性真菌病害,发病严重地块病叶率高达50%-70%,能够造成马铃薯大面积减产,危害严重。目前,生产中主要以化学农药防治为主,但由于长期不合理施用,导致病菌抗药性、农药残留、农业生态环境污染等负面影响日趋凸显。而生物防治因其具有与环境相容性好、对人畜安全等优点,成为当今农业生产中防治植物病害的热点。芽胞杆菌(Bacillus spp.)作为重要的植物病害生物防治细菌,菌株及其活性产物是目前防治植物病害安全有效和具有广阔应用前景的天然生物制剂。本研究旨在筛选对马铃薯早疫病菌具有高效生防作用的芽胞杆菌,并探究其次级代谢产物的抑菌机理,为早疫病的生物防治提供菌株资源和新途径。主要研究结果如下:1.B.subtilis ZD01是一株对马铃薯早疫病具有良好生防效果的菌株。从7个不同地理区域的马铃薯根际土壤中共分离得到213株芽胞杆菌,通过平板对峙法和室内盆栽试验筛选获得高效生防菌株ZD01。该菌株体外拮抗试验抑菌率达82.18%,5×107CFU/mL菌株发酵液的室内盆栽防效为61.08%。通过芽胞杆菌对叶片光合性能的影响分析,发现B.subtilis ZD01能够减轻早疫病菌侵染后的叶片黄化程度,维持叶片的叶绿素含量和光合性能。喷施5×103 CFU/mL、5×105 CFU/mL和5×107 CFU/mL的ZD01菌株发酵液后,叶片中叶绿素含量较对照组分别提高了 33.33%、53.70%和59.40%;叶片荧光参数图像均一,未出现低暗区域;可以提高OJIP瞬态曲线;F0、Fm、Fv/Fm和qINCB28060N等叶绿素荧光参数的变化反映了 B.subtilis ZD01能够提高叶片的PSII反应中心电子受体性能。结合全基因组序列,共预测得到3944个蛋白质编码基因,COG共注释3656个基因,占全基因组序列的82.05%。通过KEGG数据库分析表明,菌株共注释得到227条通路,包括吩嗪类、烯类和链霉素等物质的生物合成,具有产生多种次级代谢产物的能力。结合形态学及31个看家基因,鉴定ZD01为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)。2.Fengycins是B.subtilis ZD01分泌的脂肽类化合物主要活性成分,干扰马铃薯早疫病菌能量代谢和细胞壁膜的生物合成。对B.subtilis ZD01无菌上清液的生防活性进行检测,发现其能够显著抑制离体叶片病斑扩展、早疫病菌的菌丝生长和孢子萌发,且抑菌效果与发酵液相同,说明ZD01分Wnt-C59 molecular weight泌的次级代谢产物中含有有效抑菌物质。利用antiSMASH软件预测B.subtilis ZD01含有10个次级代谢产物基因簇,其中脂肽类化合物是主要抗真菌物质。通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定得到Fengycins是脂肽类化合物中关键抑菌成分,MIC值为3.91 μg/mL。为进一步探究其抑菌机理,对Fengycins处理后的马铃薯早疫病菌HWC-168菌丝进行转录组分析,表明Fengycins能够抑制早疫病菌HWC-168的核酸和能量代谢过程,导致SNF2、GAPDH、LYS1等赖氨酸和能量代谢相关基因显著下调;能够引起细胞壁和细胞膜成分的差异基因高表达,涉及CHS1、AOC3、ERG4和ERG3等几丁质及麦角甾醇代谢过程的基因。表型分析验证了 Fengycins主要引起早疫病菌菌丝细胞壁损伤,细胞膜破裂形成孔洞,细胞内物质泄露,进而影响其结构和整个细胞的正常生长;使早疫病菌几丁质和麦角甾醇的含量升高,Fengycins处理早疫病菌菌丝12 h和48 h后,几丁质含量较对照组含量分别增加41.32%和46.02%,0.5 MIC的Fengycins处理后真菌麦角甾醇含量较对照组上升了30.53%。Fengycins干扰真菌的细胞壁和细胞膜主要成分的生物合成。3.苯乙酮是B.subtilis ZD01挥发性物质的主要抑菌成分.对B.subtilis ZD01产生挥发性物质的生防活性进行检测,发现其能够显著抑制离体叶片病斑扩展、早疫病菌的菌丝生长和孢子萌发,具有良好的生防效果。采用顶空固相微萃取(HS-SPME)对B.subtilis ZD01分泌的挥发性有机物进行分离纯化,选择使用50/30-μm DVB/CAR/PDMS萃取头,萃取温度为50℃,萃取时间为40 min作为优化萃取条件。利用HP-5和FFAP两种不同极性色谱柱鉴定出匹配度≥800的化合物共有39种,二者检测得到的挥发物成分存在一定差异。非极性HP-5色谱柱检出有机物以芳香族化合物占比最多,检出特有挥发性有机物24种;极性FFAP色谱柱以酮类有机物相对含量最高,检出特有化合物10种。有5种化合物在两种色谱柱中均检测得到,其中苯乙酮含量较高,且抑菌效果显著,EC50浓度为33.45 μL/L。4.B.subtilis ZD01挥发性物质苯乙酮主要调控马铃薯早疫病菌膜转运基因Hxt,引发ROS积累.利用转录组序列分析,明确了苯乙酮主要调控早疫病菌中与细胞膜转运蛋白和氧化应激过程的关键基因的表达,差异基因主要集中在MFS(major facilitator superfamily)家族。苯乙酮处理后早疫病菌编码膜已arsenic remediation糖转运蛋白的Hxt基因差异表达最为显著。苯乙酮可引起早疫病菌细胞膜蛋白复杂的动力学变化,膜蛋白质二级结构从反平行式β-折叠向螺旋结构的改变,并引发病菌ROS积累,进一步导致早疫病菌生理功能的异常。利用同源重组技术构建敲除突变体,进一步验证苯乙酮对马铃薯早疫病菌的作用基因,发现突变体ΔHxt对苯乙酮表现不敏感性。Hxt基因在菌丝生长和分生孢子等生长特性方面没有明显差异,但在致病力过程中发挥重要作用。利用Alphafold等技术预测得到苯乙酮能够与HXT蛋白自发结合,结合位点的主要相互作用类型是氢键和范德华力,MET1、ASN134、MET150、PHE4和TRP146是HXT蛋白与苯乙酮相互作用的主要氨基酸残基。本研究筛选得到一株对马铃薯早疫病具有良好生防作用的菌株B.subtilis ZD01,明确了抗菌脂肽和挥发性物质中主效抑菌活性成分分别为Fengycins和苯乙酮;分析了 Fengycins对马铃薯早疫病菌的抑制机理;揭示了挥发性物质主效组分苯乙酮对早疫病菌编码MFS家族已糖转运蛋白HXT基因的调控作用;初步鉴定了早疫病菌Hxt的生物学功能。本研究从“生防细菌-病原真菌”互作角度深入研究枯草芽胞杆菌ZD01不同种类次级代谢产物活性成分对马铃薯早疫病菌的作用机理,首次开展挥发性有机物苯乙酮对植物病原真菌的抑制机理,为研发新防治早疫病的生防制剂提供理论基础。