1目的:2022年11月流行病调查的研究数据显示,中国糖尿病患者人数超1.4亿,其中95%是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者,居世界首位。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是T2DM最严重的并发症之一,是导致慢性肾脏疾病发展的主要病因。DN早期肾小球的病理改变以肾小球基底膜的厚度增加、肾小球体积的代偿性肥大以及系膜基质扩张为主,随后出现肾小球硬化、肾小球滤过率下降等,临床可检测到蛋白尿。足细胞是保证滤过功能稳定的重要组成成员,足细胞受损与蛋白尿的发生直接相关。桦褐孔菌(Inonotus obliquus,chaga)是一种药用真菌,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用。我们的前期工作表明,桦褐孔菌具有降低T2DM大鼠的血糖血脂、减少蛋白尿的药效作用。我们推测,桦褐孔菌对以上指标、尤其是蛋白尿的改善作用,与保护T2DM所致的足细胞损伤相关。环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP)是重要的第二信使,参与调节肾脏多种生理过程。肾脏损伤与c GMP降低直接相关,提高c GMP水平可以有效缓解肾脏损伤。c GMP水平的高低与一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,KD025 molecular weightPDE)活性密切相关,其中PDE5抑制剂,如己酮可可碱,目前已用于治疗DN患者,且具有可靠的临床疗效。基于桦褐孔菌改善T2DM大鼠血糖血脂、减少蛋白尿的前期工作基础,本研究将进一步探讨桦褐孔菌经NOS-c GMP-PDE5信号通路改善T2DM大鼠足细胞损伤、减少蛋白尿的作用机制。其中对NOS三个亚型的研究,即内皮型(e NOS)、诱导型(i NOS)、神经型(n NOS),将使我们进一步了解不同亚型可能对c GMP水平发挥不同作用的特点。2方法:2.1 T2DM模型大鼠的建立及实验分组5周龄的SD雄性大鼠为实验对象。喂养普通食物的大鼠为正常对照(normal control,NOR)组;模型组(DN)采用高脂肪饮食(high-fat diet,HFD)喂养持续8周后一次性腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg,一周内,连续测量3次随机血糖(RBG),其结果均>16.7 mmol/L判定为T2DM造模成功,模型组继续喂养HFD。药物组在HFD基础上,bone biology分别使用50和100 mg/kg(DN+Ⅰ和DN+Ⅱ)的桦褐孔菌进行干预8周,实验总计17周。2.2桦褐孔菌对T2DM大鼠糖脂代谢紊乱的影响动物饲养结束后,对所有大鼠进行生化指标测定,其中包括:体重,肾脏重量,随机血糖,总胆固醇,甘油三酯,空腹胰岛素,空腹血糖。2.3桦褐孔菌对T2DM大鼠肾脏功能的改善作用(1)通过生化分析仪和试剂盒检测血肌酐,尿肌酐,24h-尿蛋白,尿素氮。(2)将大鼠肾脏组织进行切片,采用过碘酸希夫染色,光镜下观察各组大鼠切片肾小球、系膜等的形态变化,利用K-Viewer软件测量肾小球直径,Image-Pro plus软件测量肾小球系膜区和毛细血管簇面积,根据公式计算系膜基质相对面积。2.4桦褐孔菌对T2DM大鼠足细胞损伤的改善作用(1)通过电镜观察各组大鼠足细胞的形态、肾小球基底膜的平均厚度和肾小球基底膜的长度及基底膜上裂隙孔的数,通过RADIUS图像分析软件测量得到,根据公式计算足突宽度。(2)分别通过反转录-聚合酶链反应和免疫印迹法观察足细胞标志物Nephrin、WT-1的m RNA和蛋白表达,判断足细胞的损伤情况。2.5桦褐孔菌调节T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱及肾脏足细胞损伤的机制研究(1)采用Elisa试剂盒检测大鼠第8周、13周、17周的血清c GMP的水平。(2)采用Elisa试剂盒检测第17周大鼠肾组织中c GMP的水平。(3)采用PCR和WB法检测各组大鼠肾脏的一氧化氮合酶的三种亚型:内皮型(e NOS)、诱导型(i NOS)、神经型(n NOS),和PDE5 m RNA和蛋白的表达水平。3结果:3.1桦褐孔菌改善T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱(1)在第8、13和17周,DN组的体重明显高于NOR组(P<0.01)。第17周用药组的体重明显比DN组的体重减轻(P<0.05)。DN组的肾脏重量和肾脏系数明显高于NOR组(P<0.01),与DN组相比,DN+I组和DN+II组的肾脏重量和肾脏系数明显降低(P<0.01)。(2)第17周DN组的空腹血糖明显高于第8周DN组(P<0.001),DN+I组和DN+II组在的空腹血糖水平明显低于DN组(P<0.001)。第8、13和17周DN组的总胆固醇和甘油三酯均显著高于NOR组(P<0.05)。与第8周相比,第13周和17周DN组的总胆固醇和甘油三酯水平都显著增加(P<0.01)。与DN组相比,DN+I组在第13周和第17周的总胆固醇和甘油三酯水平较低,但仅在甘油三酯水平上可以看到显著差异(P<0.05),DN+II组在第13、17周的总胆固醇和甘油三酯水平明显下降(P<0.05)。(3)在第8周,DN组、DN+I组和DN+II组的空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数均明显高于NOR组(P<0.05)。在第17周,DN组的空腹胰岛素与NOR组相比明显下降(P=0.002)。在第17周,与DN组相比,空腹胰岛素水平仅在DN+II组明显增加(P<0.05)。在第17周,DN组的胰岛素抵抗指数明显高于第8周的DN组和第17周的NOR组(P<0.001)。与DN组相比,DN+I组和DN+II组的胰岛素抵抗指数明显下降(P<0.01)。3.2桦褐孔菌改善T2DM大鼠的肾脏功能(1)第17周,DN组血肌酐、尿素氮和24h-尿蛋白的水平均显著高于NOR组和第13周的DN组(P<0.05)。DN组的尿肌酐水平和计算得到的肌酐清除率明显低于NOR组(P<0.001和P=0.015)。与DN组相购买Galunisertib比,DN+I组和DN+II组的血肌酐、尿素氮、24h-尿蛋白和尿肌酐都有明显改善(P<0.05),肌酐清除率水平仅在DN+II组有明显改善(P=0.005)。(2)与NOR组相比,DN组的肾小球直径和系膜基质相对面积明显增加(P<0.001)。与DN组相比,桦褐孔菌干预8周后,DN+I组和DN+II组的上述肾脏病理改变均有明显的降低(P<0.05)。3.3桦褐孔菌改善T2DM大鼠的足细胞损伤(1)与NOR组相比,DN组的肾小球基底膜厚度和足突宽度明显增加(P<0.001)。与DN组相比,两个桦褐孔菌治疗组对改善以上病理变化有明显效果(P<0.001)。(2)PCR和WB结果显示,与NOR组相比,DN组的Nephrin、WT-1 m RNA和蛋白水平显著降低(P<0.01),桦褐孔菌干预8周后,与DN组相比,DN+I组和DN+II组的Nephrin、WT-1表达水平均显著升高(P<0.01)。3.4桦褐孔菌升高T2DM大鼠的肾脏组织和血清中的c GMP水平Elisa结果显示,第13周和第17周,DN组的血清c GMP水平显著低于NOR组(P<0.01),DN组的肾组织c GMP也有下降趋势,但无统计学差异。与DN组相比,DN+I组和DN+II组在第13周和第17周的血清c GMP水平明显增加(P<0.001),肾组织c GMP水平仅在DN+II组显著增加(P<0.05)。3.5桦褐孔菌升高T2DM大鼠肾脏组织e NOS、n NOS,降低i NOS和PDE5 m RNA和蛋白水平(1)PCR结果显示,与NOR组相比,DN组的e NOS m RNA明显下降(P<0.01),i NOS和PDE5 m RNA水平明显增加(P<0.01),n NOS m RNA水平无统计学差异。(2)WB结果显示,与NOR组相比,DN组的e NOS和n NOS蛋白表达水平无统计学差异,i NOS和PDE5蛋白表达水平明显上升(P<0.01)。与DN组相比,DN+I组和DN+II组中e NOS和n NOS表达水平均显著增加(P<0.05),i NOS表达显著下降(P<0.05),PDE5的表达水平仅在DN+II组有统计学差异(P<0.05)。4结论:(1)桦褐孔菌可改善HFD/STZ诱导的T2DM大鼠的高血糖、高血脂及胰岛素抵抗。(2)桦褐孔菌可改善T2DM大鼠的蛋白尿、GBM增厚及足细胞的足突融合,并增加足细胞特异性标志物Nephrin、WT-1的表达。(3)桦褐孔菌可增加T2DM大鼠血液及肾脏组织中的c GMP水平,并且这个作用与增加e NOS、n NOS,降低i NOS、PDE5表达相关。综上,我们认为,桦褐孔菌通可通过改善T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱、增加c GMP水平,发挥保护T2DM大鼠的肾脏足细胞,从而降低蛋白尿的作用。