水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一,也是我国第一大口粮作物。淀粉作为水稻种子中最重要的组成部分,决定了稻米的产量和品质。淀粉的生物合成是一个复杂的酶促反应过程,目前多个淀粉合成酶类基因已被克隆,然而其调控机制还有待进一步深入研究。抽穗期作为水稻重要的农艺性状,不Dorsomorphin说明书仅决定了水稻品种的种植范围,而且影响着稻米的产量。挖掘调控水稻抽穗期关键基因,解析抽穗期调控网路,可以为水稻品种改良提供基因资源和理论依据。bZIP转录因子广泛分布于高等植物中,是一类极其重要的转录调控因子,参与调节植物的生长发育、信号传导和逆境胁迫等。目前为止,关于bZIP转录因子同时调控水稻淀粉合成和抽穗期的作用机制仍尚未报道。本研究中以bZIP34转录因子为研究对象,构建敲除突变体和过表达株系,解析了bZIP34参与调控水稻淀粉合成和抽穗期的作用机制。主要研究结果如下:1、转录因子bZIP34的特性分析。RT-qPCR结果表明转录因子bZIP34在胚和胚乳中高表达,且随着胚乳的发育,bZIP34的表达量逐渐升高,到开花后21 d开始下降。烟草叶片瞬时表达实验表明bZIP34定位于细胞核。bZIP34在酵母中没有自激活活性,可以与自身形成同源二聚体。水稻原生质体瞬时表达实验表明转录因子bZIP34具有转录抑制活性。2、实验材料的创建。在中花11背景下,利用CRISPR/Cas9技术对bZIP34的第一外显子进行基因编辑。通过测序鉴定出两个缺失A和缺失C的纯合突变体。单碱基的缺失导致移码翻译,产生一个含有138个氨基酸的蛋白质,其中位于C端的bZIP结构域完全缺失。将Ubi-bZIP34-GFP载体转入中花11获得过表达株系,通过mRNA水平的鉴定获得了bZIP34表达量分别增高7倍和10倍的两个株系。3、敲除突变体和过表达株系的籽粒表型分析。突变体糙米的粒长显著增加,粒厚显著降低,粒宽没有显著变化。过表达株系糙米的粒长、粒宽和粒厚均显著降低。千粒重统计结果显示bZIP34敲除突变体的粒重没有显著变化,过表达材料的粒重显著降低。突变体的总淀粉、可溶性糖和表观直链淀粉含量没有显著变化,过表达材料的总淀粉含量下降34%,可溶性糖含量下降43%,表观直链淀粉含量下降42%。4、bZIP34调控淀粉合成相关基Transmission of infection因的表达。RT-qPCR检测淀粉合成相关基因的表达水平,结果显示突变体中AGPS2b、GBSSI和ISA2的表达量显著升高,AGPL2的表达量降低。过表达材料中 AGPL2、AGPS1、AGPS2b、GBSSI、SSI、SSⅢa、SBE1、SBE3、ISA1和ISA2的表达量显著下调。Western blot结果显示突变体中GBSSI和SBE1的蛋白表达水平没有显著变化,过表达材料中GBSSI和SBE1的蛋白表达水平显著降低。5、bZIP34直CCRG 81045细胞培养接结合GBSSI和SBE1的启动子元件。酵母单杂交实验表明bZIP34能够直接结合GBSSI和SBE1启动子。EMSA实验结果表明bZIP34可以直接结合GBSSI启动子上的A-Box和SBE1启动子上的ACGT元件。转录因子bZIP34通过直接调控淀粉合成相关酶基因GBSSI和SBE1的表达,进而调控胚乳淀粉合成。6、bZIP34是一个水稻抽穗抑制因子。抽穗期统计结果显示,bZIP34被敲除之后几乎不影响水稻抽穗期,而bZIP34过表达植株的抽穗时间比野生型晚20 d。将Ubi-bZIP34-GFP载体转入拟南芥中,发现拟南芥抽薹延迟。以突变体和过表达株系在LD和SD条件下处理40 d的叶片为材料,RT-qPCR检测水稻抽穗关键基因的表达量,结果显示过表达材料中PHYB和Hd1的表达量没有显著变化,Ehd1、RFT1和Hd3a的表达量均显著下降。酵母单杂实验结果显示bZIP34不能直接结合Ehd1的启动子。上述结果说明bZIP34间接调控Ehd1、RFT1和Hd3a的表达,从而延迟水稻抽穗。综上所述,本研究发现bZIP34通过直接结合GBSSI和SBE1启动子上的顺式作用元件调控水稻胚乳淀粉的合成,并且可以间接的调控抽穗基因Ehd1、RFT1和Hd3a的表达来延迟水稻抽穗。研究结果将进一步丰富和充实bZIP家族转录因子参与调控植物生长发育的作用机制,为水稻抽穗期育种和品质改良提供一定的理论基础。