精氨酸甲基化是一种由精氨酸甲基转移酶(PRMTs)催化的翻译后修饰,精氨酸甲基转移酶HMT2是一种重要的表观遗传修饰因子,通过调控精氨酸的甲基化水平来参与病菌的生长发育和致病过程。但是,有关灰葡萄孢(Botrytis cinerea)精氨酸甲基转移酶的研究尚未见报道。本研究利用生物信息学的方法,对灰葡萄孢精氨酸甲基转移酶HMT2进行分析,确定了灰葡萄孢精氨酸甲基转移酶HMT2的编码基因为BcHMT2;利用同源重组技术构建了灰葡萄孢BcHMT2基因的敲除载体;通过原生质体转化技术,获得了灰葡萄孢BcHMT2基因的转化子;通过对转化子的筛选、鉴定获得了灰葡萄孢BcHMT2基因敲除突变体;通过对BcHMT2敲除突变体的表型和致病力进行分析,确定了BcHMT2基因在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能;通过对ΔBcHMT2突变体的胞壁降解酶活性以及产酸能力进行分析,探讨BcHMT2基因调控病菌致病力的机制。研究结果为阐明BcHMT2基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制奠定了重要的基础。研究结果如下:1.灰葡萄孢精氨酸甲基转移酶HMT2的生物信息学鉴定。利用生物信息学的方法,对灰葡萄孢、酿酒酵母、禾谷镰孢、稻瘟病菌、粗糙脉孢菌、黄曲霉、构巢曲霉和白色念珠菌8种真菌的精氨酸甲基转移酶HMT2进行序列比对、系统发育分析和保守结构域分析。发现在这8种真菌中,精氨酸甲基转移酶HMT2有较高的保守性,都包含Methyltransf结构域,且同源关系较近。确定了灰葡萄孢精氨酸甲基转移酶的编码基因为BcHMT2。2.灰葡萄孢BcHMT2基因敲除突变体的构建。本试验利用同源重组技术,构建了灰葡萄孢BcHMT2基因的敲除载体;利用原生质体转化技术,获得了含有潮霉素抗性的BcHMT2基因敲除转化子;通过对转化子筛选纯化以及分子鉴定,确定得到了BcHMT2基因敲除突变体ABcHMT2-1、ΔBcHMT2-2和ΔBcHMT2-3。3.灰葡萄孢BcHMT2基因在病菌生长发育和致病过程中的功能研究。本试验通过对灰葡萄孢BcHMT2基因敲除突变体的表型和致病力进行分析,发现与野生型B05.10相比,BcHMT2基因敲除突变体的生长速率明显变慢、菌核产量降低、菌丝细胞变小、孢点击此处子形态发生改变、产孢量降低、以及对番茄果实和烟草叶片的致病力显著降低。结果表明BccHMT2基因对灰葡萄孢的生长、发育和致病力具有正调控的作用。4.灰葡萄孢BcHMT2基因敲除突变体的致病因素分析。对灰葡萄孢BcHMT2基因敲除突变体的胞壁降解酶活性、胞壁降解酶基因表达以及产酸能力进行测定,结果发现,与野生型B05.10相比,突变体的胞内、胞外胞壁降解酶活性降低,胞壁降解酶基因均显著下调,产酸能力下降。这表明BcHMT2基因正调控灰葡萄孢胞壁降解酶活性及产酸能力。5.灰葡萄孢BcHMT2基因在病菌响应胁迫中的功能分析。对灰葡萄孢BcHMT2突变体响应渗透胁迫、氧化胁迫和细胞完整性的敏感性测定,发现与野生型B05.10相比,BcHMT2基因敲除突变体对NaCl、KCl、甘油和山梨醇渗CSF-1R抑制剂透胁迫Taiwan Biobank的敏感性降低了;在H2O2和甲萘醌培养基上无明显变化,不参与灰葡萄孢对氧化胁迫的影响;在响应刚果红和SDS胁迫时敏感性降低了,在氟康唑培养基上的生长速率部分低于野生型,表明BcHMT2基因的敲除可能会影响灰葡萄孢细胞完的整性。结果表明BcHMT2基因参与调控灰葡萄孢渗透胁迫和细胞完整性,进而影响病菌的生长发育和致病力。