猪囊尾蚴丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin B6和serpin 4848功能的研究

猪囊尾蚴病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫-猪囊尾蚴(Cysticercus cellulose)引起的一种人兽共患食源性寄生虫病,该病严重危害着人和动物的健康,甚至可导致死亡。猪囊尾蚴病在世界范围内仍然流行的重要原因为虫体侵入过程中的免疫逃避现象,丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)在虫体入侵过程中扮演重要角色,猪囊尾蚴表达的serpin通过调节或抑制内源性和外源性蛋白酶作用,使虫体逃避宿主的免疫攻击。本研究以猪囊尾蚴丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin B6和shepatic adenomaerpin 4848蛋白为研究对象,通过分子生物学、生物信息学、免疫学等技术和方法,探究serpin参与或介导免疫逃避的可能性,目标为阐明虫体免疫逃避机制。通过生物信息学分析对serpin B6和serpin 4848基因进行分析;利用分子生物学方法与技术,表达了猪囊尾蚴serpin B6和serpin 4848重组可溶性蛋白,并进行纯化;采用发色底物法,验证酶活性Laduviglusib NMR抑制试验;通过凝血试验,探究serpin B6和serpin 4848蛋白参与凝血级联反应的可能;通过免疫组织化学方法,对serpin B6和serpin 4848蛋白进行囊尾蚴虫体组织学定位。生物信息学分析结果显示:serpin B6和serpin 4848不含信号肽序列和跨膜结构,进化树分析显示与多房棘球绦虫serpin亲缘关系最近可能具有相似的生物学功能。原核表达并纯化了serpin B6和serpin 4848两种蛋白,Western blot结果显示可与猪囊尾蚴病阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,可为猪囊尾蚴病的筛查及诊断提供新思路;酶活性抑制试验表明serpin B6和serpin 4848皆可与胰蛋白酶这种哺乳动物消化酶类反应并抑制其活性,且具有浓度依赖性。14μg/m L浓度下,serpin B6抑制率可达79.36%,serpin 4848抑制率可达87.56%。推测这两种蛋白在寄生虫进入肠道阶段可起到免疫逃避作用;凝血试验APTT和PT数据结果表明serpin B6和serpin 4848均不参与凝血级联反应。成功制备兔多克隆抗体血清,采用ELISA方法测定抗体效价,抗体滴度均达到1:128000。免疫组化VX-661试验表明,serpin B6和serpin 4848在猪囊尾蚴中均有表达,但表达量不高,分别在吸盘和纤维层区有表达,且在吸盘处serpin4848较serpin B6表达量高。推测这两种蛋白可能参与虫体的摄取营养及促进虫体的新陈代谢。