目的:鼻上皮屏障损伤是变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)发病的最根本原因~([1])。目前已有研究证实从“修复上皮屏障损伤”-这一视角治疗AR是可行的、有效的。鼻用糖皮质激素仍是目前国内、外指南推荐治疗AR的一线药物,研究证实其能有效修复AR鼻黏膜上皮屏障损伤~([2,3])。导师田理教授创制的纯中药ABT-263试剂鼻用制剂-玉屏风加味鼻喷剂(modified Yupingfeng nasal spray)在前期研究中证实其亦能通过调控p38MAPK/PPARγ信号抑制TSLP介导的鼻黏膜炎性损伤。研究表明整合调控“AMPK-NRF2/NF-κBp65”信号在加速紧密连接蛋白的组装、修复AR鼻黏膜屏障损伤发挥着重要的作用。基于此,本课题将对比三种治疗方法(鼻用糖皮质激素、玉屏风加味鼻喷剂及中药内服)对AR大鼠鼻黏膜上皮屏障损伤修复作用,并探索玉屏风加味鼻喷剂通过整合调控“AMPK-NRF2/NF-κBp65”信号发挥作用具体的内在机制,以期为其后期临床推广应用提供参考依据。方法:将52只SD大鼠随机分为5组,分别为空白对照组10只、AR模型组10只、阳性对照组(即糠酸莫米松鼻喷雾剂组)10只、中药鼻喷剂组(即玉屏风加味鼻喷剂组)11只、中药灌胃组(即玉屏风加味鼻喷剂组成相同的药物制成的相同浓度的汤剂灌胃)11只。除空白对照组外,其余4组采用OVA联合Al(OH)_3腹腔注射建立AR大鼠模型。分别采用生理盐水、糠酸莫米松鼻喷雾剂、玉屏风加味鼻喷剂、中药灌胃进行干预,30分钟后用5%卵清蛋白溶液进行鼻内激发。末次治疗结束24小时后观察:(1)采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清中IL-13、IL-17的含量;(2)HE染色(HE staining)观察大鼠各组鼻黏膜炎性浸润情况;(3)透射电镜观察各组大鼠鼻黏膜上皮细胞超微结构的影响;(4)蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测各组大鼠鼻黏膜组织中Claudin-4、Occludin、ZO-2、AMPK、NRF2、NF-κBp65蛋白的表达量;(5)实时聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组大鼠鼻黏膜组织中Claudin-4、Occludin、ZO-1的m RNA含量;(6)免疫荧光(Immunofluorescence)检测AR大鼠鼻黏膜组织中NRF2、NF-κBp65蛋白的表达水平。结果:(1)一般情况观察:各组大鼠体重几乎均保持相似的增长速率,可见AR对大鼠体重影响较小,同时对比阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组大鼠体重,无统计学差异(P>0.05)。由此可见上述三种治疗亦对大鼠体重无明显影响。(2)大鼠鼻黏膜组织病理学观察:光镜下见空白对照组大鼠鼻黏膜表面覆以假复层柱状上皮,黏膜上皮各层细胞排列整齐,固有层内腺体细胞排列整齐,间质无水肿变性;而AR模型组大鼠黏膜上皮细胞变性坏死,固有层间质水肿,大量嗜酸性粒细胞浸润,增生的杯状细胞成簇状密集分布、体积增大,部分突破固有层,大面积腺体嗜碱变性并伴坏死、黏膜下层观察到严重水肿;阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组大鼻的黏膜均得到修复,表面覆以假复层柱状上皮,黏膜上皮及固有层内腺体细胞排列均相对整齐,结构基本完整。(3)大鼠鼻黏膜组织透射电镜观察:空白对照组大鼻黏膜上皮表面纤毛排列规则,细胞形态结构正常,各种细胞器均有序排列;AR模型组大鼠黏膜上皮纤毛稀疏,大量纤毛断裂、脱落、排列不齐,上皮排列松散,细胞体积变小,高尔基体、线粒体等细胞器减少、肿胀、空泡化;而阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组大属鼻黏膜纤毛均得到不同程度的修复。(4)ELISA检测:与空白对照组相比,AR模型组IL-13、IL-17水平显著升高,有统计学意义(P<0.01)。与AR模型组相比,阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组中的IL-13、IL-17水平下降,有统计学意义(P<0.01)。其余组间无差异(P>0.05),不具备统计学意义。(5)Western Blotting检测:与空白对照组相比,AR模型组Claudin-4、Occludin、ZO-2、AMPK、NRF2蛋白表达水平显著降低,有统计学意义(P<0.01),而NF-κBp65蛋白表达水平明显升高,有统计学意义(P<0.01);与AR模型组相比,阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组中的Claudin-4、Occludin、ZO-1、AMPK、NRF2蛋白表达水平显著升高,有统计学意义(P<0.01),而NF-κBp65蛋白表达水平明显降低,有统计学意义(P<0.01)。其余组间无差异(P>0.05),不具备统计学意义。(6)RT-PCR检测:与空白对照组相比,AR模型组Claudin-4、Occludin、ZO-1的基因转录水平显著降低,有统计学意义(P<0.01)。与AR模型组相比,阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组中Nucleic Acid Purification Search Tool的Claudin-4、Occludin、ZO-1基因转录水平提升,有统计学意义(P<0.01)。其余组间无差异(P>0.05),不具备统计学意义。(7)Immunofluorescence staining检测:在200倍、400倍镜下观察到阳性对照组、中药鼻喷剂组、中药灌胃组中NRF2蛋白表达水平均较AR模型组高,而NF-κBp65蛋白表达水平均较AR模型组低。结论:(1)在AR状态下,可见大鼠鼻黏膜组织中Claudin-4、Occludin、ZO-2蛋白及Claudin-4、Occludin、ZO-1基因的转录水平下降,大鼠鼻上皮屏障损伤;而经糠酸莫米松鼻喷剂、玉屏风加味鼻喷剂及中药灌胃干预后,均能有效促进Claudin-4、Occludin、ZO-2蛋白及Claudin-4、Occludin、ZO-1基因的转录水平,修复AR大鼠鼻上皮屏障损伤;(2)在AR状态下Z-IETD-FMK纯度,大鼠鼻黏膜组织中AMPK、NRF2蛋白表达明显减弱,NF-κBp65蛋白的表达则显著增强。而经糠酸莫米松鼻喷剂、玉屏风加味鼻喷剂及中药灌胃干预后,均能有效促进AMPK、NRF2蛋白表达,抑制NF-κBp65蛋白的表达。由此,我们推测玉屏风加味鼻喷剂可能是通过整合调控AMPK-NRF2/NF-κBp65信号修复AR大鼠鼻黏膜上皮屏障损伤。