选题依据:中药寒热药性在以下四个方面具有重要意义。临床应用:寒热药性是中药的重要属性之一,对中药的临床应用有重要意义。根据患者的体质、病情和环境等因素,选择合适的寒热性药物,可以达到良好的治疗效果。药物研究:寒热药性也是中药药理研究的重要方向之一。通过研究药物的寒热性质,可以深入了解药物的作用机理,并为开发新型中药提供理论依据。药性归类:寒热药性是中药药性分类的一种,对药物的归类、整理和规范paediatric primary immunodeficiency有重要意义。在中药的配伍和应用中,药性分类是一个重要的参考依据。理论研究:中药理论中的寒热平衡理论是中药理论的重要组成部分,通过研究寒热药性,可以深入探讨中药理论中的寒热平衡机制,为中医学的发展提供理论支持。但中药的寒热性产生的原因至今没有得到很好的解释。采用科学的手段解释清楚中药寒热药性产生的原因对于提升中医用药科学性乃至中医药走向全世界具有重要意义。希望能够从物质和对机体作用通道两方面入手探究中药寒热药性产生的原因。生地黄其性凉味甘,具有IACS-10759养阴清热和凉血生津功效。熟地黄,性微温味甘,具有滋阴补血和益精填髓的功效~([2])。地黄中含量最高的是糖类成分,且加工炮制后糖类成分发生显著变化。此前有报道显示糖类与中药的寒热药性有相关性,通过探究地黄多糖与生、熟地黄药性的转变是否相关有助于揭示寒热药性产生的原因。寒热药性对机体的影响表现在体温、能量代谢等各方面,这些指标的改变是确定寒热药性的依据。并且有报道显示寒热会影响机体肠道菌群。有研究发现一些中药能够激活或者抑制哺乳动物细胞表面与温度相关的TRP通道,从而产生一系列反应并且影响能量代谢,TRP通道可能与寒热药性相关。如辣椒素激活TRPV1通道产生灼热感,薄荷醇激活TRPM更多8通道产生清凉感,这种初步的感受也是人们判定寒热药性的依据之一。有研究发现辣椒素可以激活TRPV1通道使细胞内ATP含量升高,而使用TRPV1的抑制剂后细胞内ATP含量降低;热性药中的次乌头碱可以激活TRPV4通道使细胞内温度升高,黄芩苷则抑制TRPV4通道使细胞内温度降低。这些发现与动物实验发现热性药可以提高动物的能量代谢、体温,寒性药则是抑制能量代谢、降低体温相吻合。目前已经发现某些中药化合物它们的TRP通道靶标,推测中药的寒热药性可能与调节TRP通道的表达有关,但这一猜测仍有待进一步研究。目的:先探究地黄多糖变化,再从理化指标及TRP通道表达方面探究地黄多糖与寒热药性的相关性。方法:(1)中药地黄利用水提醇沉法提取地黄多糖,接着通过木瓜蛋白酶法去除多糖中的蛋白,然后再利用苯酚硫酸法测定多糖浓度,最后使用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。用高效液相色谱研究了地黄多糖的分子量,用完全酸水解结合衍生化的方法研究了寡糖片段的单糖组成,用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测定了多糖中存在的特殊官能团结构。通过正交实验确定三氟乙酸及H_2O_2降解地黄多糖的最降解解条件,考察了降解温度、降解时间和试剂浓度对多糖降解产物的影响,最后确定降解地黄多糖的最优降解条件。(2)通过还原活性测试及NO清除实验对地黄多糖进行体外抗氧化活性测试。(3)通过对小鼠的体温、饮水量等进行寒热指标判断。通过检测肝脏组织ATP含量判断能量代谢情况。通过探究TRPV1、TRPV4、TRPM8空间分布与表达量情况,探究寒、热药性与TRP通道表达的相关性以及判断生熟地黄多糖的寒、热药性。通过对小鼠粪便菌群分析探究寒热药性与分粪便菌群的关系。结果:1.鲜、生、熟地黄多糖有分子量主要为200KDa和4KDa,炮制后大分子量多糖含量增加,小分子多糖含量减少。地黄多糖中鲜地黄多糖种类最多,是由葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸9种单糖组成,生地黄多糖是由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖和半乳糖醛酸7种单糖组成,熟地黄多糖是由葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和半乳糖醛酸6种单糖组成。鲜、生、熟地黄多糖官能团均显示出相似的信号峰,即多糖的特征信号3350-3400cm~(-1):羟基伸缩振动;2950-3000cm~(-1):CH_2基团的C-H伸缩振动;1600-1650cm~(-1):CHO和C=O键的伸缩振动;1375-1425cm~(-1):C-H键振动;950-1150cm~(-1):C-O-C和C-O-H键吸收。水解温度80℃,三氟乙酸浓度1.0 mol/L,水解时间1 h是地黄多糖三氟乙酸酸解的最佳条件。过氧化氢水解发现,改变水解温度,过氧化氢浓度或水解时间,水解结果基本没有变化。但相比于三氟乙酸水解,过氧化氢水解的寡糖片段更多、含量更高并且水解方法简单,为后续地黄寡糖的开发奠定了基础。2.随着浓度增加,地黄多糖及水提液的还原性逐渐增强;还原性:熟地黄多糖>生地黄多糖>鲜地黄多糖,熟地黄水提液>生地黄水提液>鲜地黄水提液;鲜、生、熟地黄水提液的还原性比多糖要强。随着浓度增加,地黄多糖及水提液的NO清除率逐渐增强;NO清除率:熟地黄多糖>生地黄多糖>鲜地黄多糖,熟地黄水提液>生地黄水提液>鲜地黄水提液;水提液的NO清除率比多糖要强。相同质量浓度下,地黄水提液抗氧化性强于地黄多糖。3.通过体温、饮水量等寒热评价,发现地黄多糖组与水提液组变化类似,即生地黄水提液、生地黄多糖表现为寒性,熟地黄水提液、熟地黄多糖表现为热性。通过DSS评分发现,生、熟地黄多糖及水提液均对DSS诱导的结肠炎有改善作用。肝脏ATP表达量,熟地黄水提液组>正常组>生地黄水提液组,熟地黄多糖组>正常组>生地黄多糖组。TRP通道免疫组化发现生地黄水提液及多糖可以降低小鼠结肠粘膜层TRPV1的表达,升高TRPM8的表达;熟地黄水提液及多糖则相反,升高小鼠结肠粘膜层TRPV1的表达,降低TRPM8的表达;TRPV4的表达,对照组、生、熟地黄水提液及多糖组无明显差异。粪便菌群多样性分析发现,与对照组相比,地黄水提液及多糖增加了粪便菌群的多样性,并且多糖的粪便菌群多样性更加丰富。生、熟地黄水提液及多糖并没有显示出明显的寒热药性对粪便菌群的影响,原因可能与作用时间不够有关,需进一步探究。结论:本研究以生、熟多糖为研究对象,先通过对生、熟多糖分子量、官能团、单糖组成分析,初步了解生、熟多糖分子构象变化。再通过体外抗氧化实验了解生、熟多糖及水提液的体外抗氧化性,发现体外抗氧化性:熟地黄多糖>生地黄多糖>鲜地黄多糖,熟地黄水提液>生地黄水提液>鲜地黄水提液;水提液的抗氧化性比多糖要强。最后进行体内实验,以DSS造模的溃疡性结肠炎小鼠为模型,发现生、熟地黄多糖与生、熟地黄水提液的寒热性表现一致。本研究为进一步探索寒热药性与糖类关系奠定了基础,也为寒热药性研究提供了研究思路。