目的:目前关于甲基化和乙酰化修饰的报道以调控肿瘤机制作用为主,在修饰病毒的机制以及对病毒毒力的改变,宿主细胞和病毒之间修饰的相互影响这些方面少有提及。本课题组之前的研究结果表明,感染RSV可激活细胞的先天性免疫RIG-I信号通路,但是感染后RIG-I的作用机制一直都在研究中。综上所述,本课题研究目的是呼吸道合胞病毒(RSV)感染Hela细胞之后,对各甲基化修饰筛选出修饰影响最大的甲基化修饰酶(m~6A修饰酶ALKBH5、m~1A修饰相关酶ALKBH3、m~7G修饰相关酶METTL1、m~5C修饰相关酶NSUN2)和乙酰化修饰ac4C相关调节酶NAT10对RSV感染复制增殖和先天性免疫起了何种作用,以及各修饰对相关的信号通道的上调或者下调,对修饰如何调控RSV病毒和宿主的机制做出相应的研究并为开发全年龄段疫苗和寻找药物新靶标提供一个新的思路和方向。方法:根据目的蛋白的Emricasan说明书全部基因序列,由通用生物公司设计合成ALKBH5(m~6A修饰相关酶)、NAT10(ac4C修饰相关酶)慢病毒,由擎科生物有限公司设计合成si-ALKBH3(m~1A修饰相关酶)、si-METTL1(m~7G修饰相关酶)、si-NSUN2(m~5C修饰相关酶)、si ALKBH5和si NAT10同时按照相应实验分组,选取培养贴壁的Hela细胞,构建好慢病毒和si RNA对Hela进行感染培养,培养后使用流式分选仪对感染慢病毒的Hela细胞进行分选得出稳定过表达细胞株。在正常Hela细胞、已进行稳定过表达的Hela细胞株和si RNA转染的Hela细胞株,这些不同组别的Hela细胞感染呼吸道合胞病毒4-48h(以4h、12h、24h、48h为代表收取样本)之后,运用一些常规使用的实验方法和技术如激光共聚焦显微镜、蛋白免疫印迹、分子生物学以及m~6A-seq和ac4C-seq等,分别检测ALKBH5、NAT10和RSV病毒蛋白M、F的共定位以及结合情况、RIG-I和LC3蛋白、IFN-α和IFN-βm RNA和蛋白的表达水平等,明确m~6A以及ac4C在Hela细胞感染RSV后对病毒复制产生的促进作用。以此用来说明m~6A和ac4C在对RSV感染后所致的先天免疫抑制干扰素产生的可能机制及感染中激活的相关信号通路。结果:(1)经过q RT-PCR检测结果发现:Hela细胞感染RSV 4h、12h、24h和48h这四个时间点的各修饰酶的表达量,与mock组相比,均有变化,其中ALKBH5在感染24h和48h表达量降低出现统计学意义,其他修饰酶均未出现明显差异,结合文献报道以及我们的结果表明:在RSV感染过程中去甲基修饰酶ALKBH5可能发挥了最大的调控作用。(2)激光共聚焦结果表明:在ALKBH5和NAT10慢病毒分别感染Hela细胞后,使用激光共聚焦显微镜观察ALKBH5和NAT10与病毒蛋白F、M有一定的共定位情况。我们推测m~6A修饰分子和ac4C修饰分子与病毒功能蛋白可能存在相互作用。(3)q RT-PCR结果显示:在正常Hela细胞和干扰的各组细胞被RSV感染后,以未感染的细胞对照组(mock组),RSV感染的各组细胞M蛋白、RIG-I、IFN-α和IFN-β的基因表达含量与正常组对比来看有上升趋势。与正常Hela组相比,ALKBH5(m~6A修饰分子)干扰组和ALKBH3(m~1A修饰分子)干扰组的M蛋白表达水平均有一定程度的明显升高,RIG-I蛋白以及其下游调控的IFNs m RNA表达水平有一定的下降,而NAT10(ac4C修饰分子)干扰组、METTL1(m~7G修饰分子)干扰组和NSUN2(m~5C修饰分子)干扰组的M蛋白m RNA表达水平有一定程度的降低,RIG-I蛋白以及其下游调控的干扰素m RNA表达水平对比来看有一定升高。综合来看几种甲基化修饰中m~6A的调控作用更明显。(4)蛋白免疫印迹结果显示:mock组中RIG-I和LC3表达水平含量并不高。Hela组、ALKBH5(m~6A修饰分子)过表达组、NAT10(ac4C修饰分子)过表达组以及ALKBH5(m~6A修饰分子)干扰组和NAT10(ac4C修饰分子)干扰组,各组被RSV分时间段感染后,可发现蛋白RIG-I和LC3表达量较未感染mock组有所增加,对比正常Hela组敲低的ALKBH5和过表达的NAT10组RIG-I蛋白表达降低,LC3蛋白表达增高;敲低的NAT10和过表达ALKBH5组的RIG-I蛋白表达升高,LC3蛋白表达降低MDV3100(在感染24h时差异具有统计学意义)。(5)ELISA结果显示:Hela组、ALKBH5(m~6A修饰分子)过表达组、NAT10(ac4C修饰分子)过表达组以及ALKBH5(m~6A修饰分子)干扰组和NAT10(ac4C修饰分子)干扰组,各组被RSV分时间段感染后,可发现IFNs表达量较未感染mock组有所增加,对比正常Hela组敲低的ALKBH5和过表达的NAT10组IFNs表达降低;敲低的NAT10和过表达ALKBH5组的IFNs表达升高,(在感染12h时差异具有统计学意义)。(6)测序结果显示:m~6A修饰和ac4C修饰在修饰前后多集中于CDS区,并且可见m~6A与ac4Cpeaks增加,可见感染RSV促进了m6A的修饰作用。在GO分析中我们得出结论对于m~6A上调主要富集的是线粒体去极化和色氨酸代谢相关基因,而下调主要富集的是RNA聚合酶II转录辅激活子和结合子相关基因,对于ac4C上调主要富集的是细胞核蛋白质输出的调节和凋亡相关基因,下调主要富集的是高尔基体本体化和应激颗粒相关基因,KEGG中m~6A有NF-κB通路的差异改变,ac4C有MAPK和HIF-1通路的graphene-based biosensors差异改变。结论:在Hela细胞中,各甲基化修饰酶以及乙酰化修饰酶在RSV感染中起着重要作用,甲基化修饰和乙酰化修饰促进了RSV的复制。我们的结果展现出,甲基化修饰与乙酰化修饰在RSV感染Hela细胞的过程中修饰集中于CDS区,通过各种调控酶的作用使其复制增殖改变,m~6A修饰酶ALKBH5和ac4C修饰酶NAT10与病毒蛋白M、F有一定的共定位,提醒我们修饰可能直接与病毒有互作,抑制NAT或过表达ALKBH5导致自噬减少,RIG-I受体上调,RSV复制减少,下游更高水平IFN-α和IFN-β表达,最终对RSV感染起到抑制的作用,KEGG中m~6A有NF-κB通路的差异改变,ac4C有MAPK和HIF-1通路的差异改变,且这些通路都与炎症反应有关。