目的(1)建立小鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)模型,探究小鼠SCI后病灶区脊髓铁死亡的表现以及时间点。(2)探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对SCI小鼠神经元铁死亡及运动功能恢复的影响。(3)探究白藜芦醇抑制SCI后铁死亡的机制。方法(1)通过脊髓精密打击器(RWD68099II)建立c57小鼠T10段SCI模型,并随机分为6组,包括sham组,SCI-1d组,SCI-3d组,SCI-5d组,SCI-7d组,SCI-14d组。利用蛋白印迹分析(Westernbloting,WB)技术检测各组病灶区脊髓中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4),溶质载体家族7成员11(xCT),铁转运蛋白(FPN),铁蛋白重链1(FTH1)以及酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)等铁死亡相关蛋白的表达水平;通过普鲁士蓝DAB(diaminobenzidine)加强染色检测各组病灶区脊髓铁离子的表达水平。(2)将小鼠随机分为4组,分别是假手术组(sham组),SCI组,SCI+溶剂组(SCI+V 组),SCI+Res(200mg/kg)组。利用 Basso Mouse Scale score(BMS评分)和足迹分析评定各组小鼠后肢运动功能的恢复情况;通过苏木精伊红(hematoxylin eosin,HE)染色观察损Mediterranean and middle-eastern cuisine伤段脊髓形态的变化;通过尼式(Nissl)染色及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色观察损伤段脊髓正常和变性神经元的表达情况。利用WB检测各组脊髓铁死亡相关蛋白的表达情况。通过试剂盒检测各组病灶区脊髓中谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量、GPX4活性的水平和二价铁离子(Fe2+)的浓度。通过透射电镜观察病灶区脊髓神经元细胞及其线粒体形态。通过普鲁士蓝DAB加强染色检测各组脊髓病灶区神经元铁离子的沉积情况。(3)将小鼠随机分为2组,分别是SCI+Res组和SCI+Res+ML385组(核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂)(30mg/kg)。利用WB检测Nrf2/GPX4通路相关蛋白的表达情况。结果(1)WB结果显示,和sham组相比,xCT和GPX4的表达在损伤后呈下降趋势,于第3天显著降低(p<0.01),随后有不同程度的升高。ACSL4在损伤后表达降低,随后于第3天显著增加(p<0.01),达到高峰。FTHI的表达在损伤后呈上升趋势,并在第5天显著增加(p<0.01)。损伤后各时间点FPN的表达都显著降低(p<0.01)。普鲁士蓝染色结果显示,与sham组相比,损伤后各时间点脊髓病灶区神经元铁离子的沉积情况都有不同程度的升高,于第3天达到高峰(p<0.01),随后呈下降趋势。(2)BMS评分结果显示,SCI后14,21,28,35天,SCI+Res治疗组评分明显高于SCI+V组(p<0.05)。损伤后第35天进行足迹测试。结果显示,与SCI和SCI+溶剂组小鼠相比,Res治疗小鼠的步态恢复和运动协调能力得到显著改善(p<0.01)。(3)HE染色结果显示,Res减轻损伤后病灶区的病理性形态改变。Nissl染色显示,与SCI组相比,Res可以保留更多存活的神经元(p<0.01)。FJC染色结果显示,SCI3d后病灶区变性的神经元表达最多(p<0.05),与SCI+V组相比,Res可以抑制神经元变性(p<0.05)。正结果显示,Res抑制了神经元的死亡(p<0.05)。(4)透射电镜观察显示,SCI后线粒体皱缩,线粒体嵴减少,而Res明显改善线粒体的形态。(5)普鲁士蓝DAB加强染色显示,SCI后病灶区MLN8237出现病理性的褐色铁离子,用Res干预后,明显降低了铁离子的沉积情况(p<0.05)。铁离子试剂盒检测损伤段脊髓铁离子表达情况,结果显示,与SCI+V组相比,Res降低铁离子的表达(p<0.05)。同时,Res还可以降低MDA的表达,促进GPX4的活性和GSH的表达。(6)WB结果显示,与SCI+V组相比,Res干预后上调了 GPX4,xCT,FPN,FTH1等铁死亡相关蛋白的表达,并在使用Nrf2特异性抑制剂ML385后抑制了 Res的上调效应(p<0,05)。结论(1)小鼠SCI早期即出现神经元细胞铁死亡现象,并在第三天达到高峰。(2)Res可以改善小鼠SCI后病灶区脊髓神经元铁的沉积,并且促进SCI后神经及运动功能的恢复。(3Blebbistatin纯度)Res可能通过Nrf2/GPX4通路抑制神经元铁死亡,减轻SCI继发性损伤,促进功能恢复。