随着我国猪养殖业的快速发展,猪细菌性疾病出现的频率越来越高,且呈地方流行性,如果不能及时控制,极易造成病情的蔓延和加剧。致病性大肠杆菌是一种重要的肠道病原体,会导致仔猪的肠道菌群发生变化,造成严重腹泻,甚至死亡。特别是断奶前后的仔猪,常给养猪业造成重大经济损失。大肠杆菌存在较多血清分型,临床治疗上大多选用抗生素进行治疗,但长期使用抗生素会影响肠道的共生微生物群,导致肠道菌群失调,直接影响仔猪的健康,且长期使用抗生素会导致动物产品中出现药物残留超标的问题,危害人类的健康。中药有抗菌、无药物残留、副作用小的特点,发酵中药是在中药传承的基础上,结合现代的先进研究手段的创新技术,可以调节肠道菌群平衡、增强中药活性、提高机体免疫力。近年来因其绿色、天然、药效快等特点被广泛应用于畜牧养殖业。因此,寻找较好的发酵中药复方作为替代物来治疗仔猪大肠杆菌病成为了研究焦点。本研究Baricitinib为了寻求有效的、治疗效果好且能维系肠道菌群稳定的中药发酵复方,从清热解毒、涩肠止泻、收敛固涩、止痛为主治功能的单味中药入手挑选了34味中药,进行体外抑菌试验,再结合中兽医理论建立复方。复方建立后通过动物实验进行初步筛选,并将筛选出的最终中药复方用鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌四种益生菌分别发酵,以从吉林省采集的样本分离出的大肠杆菌进行造模,探究中药发酵复方对仔猪大肠杆菌的治疗效果,为研究和开发中药发酵防治该病提供参考。研究内容及结果如下:1.致病性大肠杆菌分离与鉴定。从长春周边某养殖场采集腹泻仔猪肛门拭子样本,通过麦康凯琼脂培养基、大肠杆菌显色培养基、显微镜检查以及生化试验对细菌进行初步鉴定,然后通过PCR法进行进一步检测。检测结果显示,基因扩增条带大小为1500bp左右,序列分析为大肠杆菌。并通过动物致病性试验筛选出一株致病性大肠杆菌E-3。2.中药复方的建立及小鼠腹泻模型的构建。选取20 g左右的昆明小鼠50只,随机分为5组,四组实验组腹腔注射大肠杆菌E-3,注射浓度分别为1×10~8cfu/m L、2×10~8cfu/m L、3×10~8cfu/m L、4×10~8cfu/m L,对照组注射生理盐水。结果表明,3×10~8cfu/m L为注射的最佳浓度。通过查阅文献,从清热解毒、涩肠止泻、收敛固涩、止痛等为主治功能的单味中药选取34味中药,通过水提和醇提两种方法对34味中药的有效成分进行提取,调整中药浓度为1 g/m L。采用琼脂打孔法进行药敏试验,筛选出11味抑菌效果好的中药。并对这11味中药进行联合药敏试验。根据联合药敏结果,结合中兽医理论,建立出7组中药复方,通过与西药进行体外抑菌对比结果,筛选出三组最佳复方。3.中药复方筛选。选取20 g左右的昆明小鼠50只,随机分为5组,分别为中药复方一组、中药复方二组、中药复方三组、攻菌对照组、健康对照组。除健康对照组外,其余四组均腹腔注射菌液浓度为3×10~8 cfu/m L的大肠杆菌0.5 m L,待出现症状后,连续7天对中药组小鼠灌服药物0.2 m L,每日记录小鼠的采食量、体重、治愈率、死亡率。在治疗前和治疗中3天、5天和7天分别采集各组小鼠的血液,测定免疫指标;并取其十二指肠和回肠的中段,制作病理切片,观察病理变化。结果显示,中药复方二组平均增重和采食量均大于其他四组,差异显著(P<0.0CB-839研究购买5),治愈率达到100%。中药复方二组小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8以及TNF-α的含量与其他四组差异显著(P<0.05)。病理切片结果显示,中药复方二组小鼠的肠腺结构比较完整,肠绒毛修复明显,其肠绒毛修复程度高于中药复方一组和中药复方三组。综合各项结果来看,中药复方二组的治疗效果优于中药复方一组和中药复方三组,中药复方一组的治疗效果优于中药复方三组,中药复方三组的治疗效果较差。4.益生菌发酵中药复方产物对小鼠感染大肠杆菌的治疗效果研究。选取20 g左右的昆明小鼠60只,随机分为6组,分别为枯草芽孢杆菌发酵组、植物乳杆菌发酵组、鼠李糖乳杆菌发酵组、凝结芽孢杆菌发酵组、攻菌对照组、健康对照组。除健康对照组外,其余五组均腹腔注射菌液浓度为3×10~8 cfu/m L的大肠杆菌0.5 m L,待出现症状后,连续7天对发酵组小鼠灌服药物0.2 m L,每日记录小鼠的采食量、体重、治愈率、死亡率。在治疗前和治疗中3天、5天和7天分别采集各组小鼠的血液,multilevel mediation测定免疫指标;并取其十二指肠和回肠的中段,制作病理切片,观察病理变化。结果显示,鼠李糖乳杆菌发酵组小鼠的平均增重与攻菌对照组、健康对照组差异显著(P<0.05)。其小鼠采食量均大于其他五组,与除健康对照组外的其他四组差异显著(P<0.05),治愈率达到100%。鼠李糖乳杆菌发酵组小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8以及TNF-α的含量与其他五组差异显著(P<0.05)。病理切片结果显示,鼠李糖乳杆菌发酵组小鼠肠腺结构完整,肠绒毛恢复较好,肠粘膜连续清晰,无炎性细胞浸润,相较于其他组肠道修复效果较好。综合各项结果来看,四组发酵复方均能有效治疗小鼠大肠杆菌腹泻,但鼠李糖乳杆菌发酵复方的治疗效果最好。综上所述,本实验成功从仔猪肛门拭子样本中分离出一株致病性大肠杆菌,并成功建立小鼠腹泻模型。根据一系列药敏结果以及中药配伍禁忌,建立筛选出三组中药复方。各项指标测定结果表明,中药复方二治疗效果良好,且经益生菌发酵后其治疗效果有所增强,其中经鼠李糖乳杆菌发酵后治疗效果最佳。