木质纤维素生物质,如农业和林业残留物、纸浆厂废弃物和能源作物,由于其高碳水化合物储存,被视为生产生物乙醇的制造过程中糖的良好替代品。因此,近年来人们通过酶水解方法从木质纤维素转化可发酵糖方面做出了巨大努力。纤维素酶在酶水解过程中可以与木质素非生产性结合,对酶解消化率产生负面影响。预处理可以破坏致密的木质纤维素结构,降解大量木质素显著提高木质纤维素生物质的酶消化率。然而,完全去除木质素的成本昂贵,并且严苛的处理条件会导致高碳水化合物损失。可以使用添加剂来减少纤维素酶对底物木质素的非生产性吸附以增强酶的糖化效果。磺化木质素能显著促进木质纤维素底物的酶水解。木质素是一种多酚类化合物,因此,磺化多酚可能具有类似的效果。本课题将单宁酸(TA)磺甲基化制得五种不同磺化度的磺甲基化单宁酸(STA),将其作为8%Na OH预处理麦草酶水解添加剂,探究STA对木质纤维素酶水解和纤维素酶吸附的影响。并且探究STA对酶水解体系p H值的影响以及不同p H值对以STA为添加剂的酶水解糖转化率的影响。(1)制备不同磺化度的磺甲基化单宁酸。通过控制亚硫酸钠的用量制备了不同磺化度(即不同磺酸基含量)的磺甲基化单宁酸(STA)。磺酸基含量分别为0.9,SB431542溶解度1.2,1.8,2.4,3.0 mmol/L的磺甲基化单宁酸,称为STA-0.9,STA-1.2,STPF-6463922作用A-1.8,STA-2.4,STA-3.0;且在本研究的亚硫酸钠用量范围内,STA的磺酸基含量随着亚硫酸钠用量的增加呈线性增加。(2)STA对酶水解的影响。研究了TA与STA对Na OH预处理麦草酶水解效率的影响。结果表明,酶水解效率与STA的磺化程度密切相关。TA对底物的酶消化率有较强的抑制作用,而STA对底物酶消化率有较强的促进作用。单宁酸浓度越高对酶水解的抑制作用越强,添加1.6 g/L的TA完全抑制酶水解。不同磺化度的STA对酶水解的促进作用不同。对于低磺化度的STA(STA-0.9,STA-1.2,STA-1.8)随着添加浓度升高(0-1.6 g/L),对酶水解的促进作用不断上升;但过多且磺化度高(≥2.4 mmol/g)的STA不利于进一步提高糖转化率。添加0.8 g/L的STA-2.4对酶水解的促进效果最明显,低纤维素酶用量(5 FPU/g-葡聚糖)下的葡聚糖转化率由60.6%提高到97.9%。(3)TA与STA对酶水解过程中纤维素酶吸附的影响。在酶水解过程中,大部分纤维素酶被底物快速吸附。TA的添加抑制了酶水解液中的可溶性游离蛋白含量;而STA的加入则提高了游离蛋白含量,纤维素酶在底物上非生产性吸附显著减少。在24 h内,底物上吸附的纤维素酶蛋白与水解产物的酶蛋白已经接近平衡。添加0.8 g/L的STA-2.4水解96 h后,上清液中游离蛋白由0.0174 mg/m L增加到0.0734 mg/m L,即纤维素酶吸附在底物上的量由87%下降到44%。在一定的STA添加浓度(0～1.6 g/L)范围内,添加磺化度较低(<2.4 mmol/g)的STA,游离蛋白含量几乎呈线性增加。而加入磺化程度较高的STA(≥2.4mmol/g),游离蛋白含量先上升后下降。根据酶水解葡聚糖含量与游离蛋白含量的关系,添加STA后,葡聚糖产量随着游离蛋白含量的增加而增加。高磺化度的STA能够结合更多的纤维素酶,不过在高浓度下可能聚集沉淀。与添加STA-2.4相比,添加STA-3.0的酶水解体系中单位游离蛋白的糖转化效率较低,很可能因为STA-3.0携带更多负电荷所形成的STA-Cel聚集体与纤维素之间的结合相对不稳定。综合来看,磺化度较高的STA能更有效地抑制纤维素酶对底物木质素的非生产性吸附,从而显著促进底物酶水解。荧光光谱可用来研究化学分子和酶蛋白之间的结合机制,因其反映了猝灭常数、结合常数等信息;荧光发射光谱说明TA、STA与纤维素酶之间确实存在相互作用,且它们二者对纤维素酶的荧光猝灭机制为静态猝灭作用。(4)pH对添加STA的酶水解体系的酶水解及酶吸附的Mesoporous nanobioglass影响。对于不添加STA和添加STA-0.9,STA-2.4的酶水解体系,随着缓冲液p H由4.4上升到4.8,酶水解糖转化率先不断增加;当p H值超过4.8时,酶水解糖转化率略有下降。p H对酶水解的影响作用与p H影响纤维素酶电负性、底物电负性、底物木质素亲水性以及纤维素酶活性有关。与酶水解糖转化率规律一致,缓冲液p H升高,上清液中游离蛋白含量略微上升,随着缓冲液p H继续提高,上清液游离蛋白含量略下降。在不同p H的缓冲液中,酶水解液中游离蛋白含量变化不明显。p H=4.8为对酶水解糖转化率最有利的酶水解pH值。