研究背景肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)是肠神经元相互连接形成的整合和处理信息的神经网络BAY 73-4506,具有高度的自主性,可以相对独立地调控肠道功能,被称作胃肠道的“微型脑”。近期有研究发现,成年后,成熟肠神经元依旧存在着不断的凋亡和增殖,其中增殖主要依靠肠神经前体细胞(Enteric neural precursor cells,ENPCs)实现,二者之间的动态平衡是维持ENS生理功能的基础。许多因素会导致ENS结构的损伤和功能的紊乱,如神经毒性药物、神经退行性变等。长春新碱(Vincristine,VCR)作为临床常用的抗肿瘤药物,其导致的外周神经毒性是许多患者无法耐受的重要原因。VCR治疗后,肠道的运动功能明显下降,可能与肠神经损伤有关。VCR还可触发肠道免疫反应,其中肠巨噬细胞是肠道免疫反应的重要调节者,在不同条件下可极化为抗炎和促炎两种表型。肠巨噬细胞和肠神经元之间的相互作用参与维持ENS的功能。然而,VCR导致肠神经损伤的机制尚不明确,肠巨噬细胞在其中是否发挥重要作用也未可知。肠道的衰老与肠神经退行性变有关。老年人和老年实验动物胃肠传输时间延长,肠神经元受损,表现为数目减少、形态异常、纤维肿胀等。目前,有关肠神经退行性变机制的研究大多集中在氧化应激、炎症反应等方面,对于肠神经元增殖的调控研究较少。胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)在一些神经退行性疾病的病人中分泌减少,并且,ENPCs的增殖、分化以及成熟神经元的存活也受GDNF的影响。因此,目前认为GDNF信号系统是治疗神经退行性变的重要潜在靶点。缩宫素(Oxytocin,OT)是第一个确定结构并且能够化学合成的具有生物活性的肽类激素。除下丘脑以外,包括消化道在内的其他器官也分泌OT。OT通过与其受体(Oxytocin receptor,OTR)结合发挥生物学功能。OTR表达广泛,几乎遍布机体各器官。OT的经典作用是刺激子宫收缩和泌乳反射,近些年发现OT参与了机体多种生理功能的调控,包括抗炎、抗氧化、镇痛、镇静、调节血压、参与学习和记忆等;OT还参与调节包括胶质细胞在内的多种细胞的增殖和分化。但是,OT在肠神经损伤中的作用以及具体机制尚不清楚。本研究通过建立神经毒性药物(长春新碱)诱导以及神经退行性变(衰老)两种ENS损伤模型,揭示了 OT在VCR及衰老导致的ENS损伤中的作用及机制,进一步拓展了对OT功能的认识,为ENS损伤的临床治疗提供新的思路。第一部分缩宫素在长春新碱导致的肠神经损伤中的作用及机制研究研究目的既往研究表明,VCR导致神经损伤,伴随免疫反应的发生;OT具有神经保护的功能,但其对VCR导致的肠神经损伤的影响尚不明确。本部分通过建立VCR诱导的肠神经损伤模型,探究VCR导致肠神经损伤的机制以及肠巨噬细胞在其中发挥的作用;然后通过给予外源性OT,探究OT在VCR导致的肠神经损伤中的作用及机制。研究方法1.动物模型的制备(1)VCR致神经损伤模型制备:小鼠腹腔注射生理盐水(Normal saline,NS)或VCR(0.1 mg/kg),连续 10 天。(2)肠道巨噬细胞清除实验:小鼠每3天腹腔注射200μl氯膦酸二钠脂质体或对照脂质体,第1次给药后次日连续10天腹腔注射NS或VCR(0.1 mg/kg)。(3)OT的肠神经保护实验:小鼠腹腔注射NS或OT(1mg/kg)1h后,腹腔注射NS 或 VCR(0.1 mg/kg),连续 10 天。2.小鼠结肠肌间神经元分离与培养使用解剖器械依次去除小鼠结肠黏膜、黏膜下层、环形肌和浆膜,制备纵行肌-肌间神经丛(Longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP)标本。LMMP 标本通过 55 min木瓜蛋白酶(10 mg/ml)和55 min胶原酶Ⅱ(1mg/ml)的消化后,分离肌间神经元并体外培养。3.小鼠腹腔巨噬细胞上清液条件培养结肠肌间神经元体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,收集不同药物刺激后的细胞上清液作为条件培养基,加入体外培养的结肠肌间神经元中继续培养,观察条件培养基对肠神经的损伤情况。4.采用Percoll梯度离心的方法分离小鼠结肠单个核细胞,利用流式细胞术检测其中CD86+促炎型巨噬细胞及CD206+抑炎型巨噬细胞的比例。5.采用免疫荧光技术检测βⅢ-Tubulin+肌间神经元数目及轴突长度的变化。6.采用qRT-PCR技术检测结肠LMMP及RAW264.7巨噬细胞中炎症因子的mRNA表达情况。7.采用RNA-Seq技术检测结肠LMMP中mRNA的差异表达情况。8.采用ELISA检测细胞培养液上清及组织匀浆中炎症因子的蛋白浓度变化。9.采用Western blot检测RAW264.7巨噬细胞中P38、P44/42蛋白的表达及结肠LMMP和条件培养的神经元中SGK1、FOXO3、Cleaved caspase-3蛋白的表达情况。10.采用TUNEL染色检测结肠组织中凋亡神经元的数目变化。11.采用GITT检测胃肠道的运动功能。研究结果1.VCR导致结肠肌间神经元损伤及肠道运动功能障碍小鼠腹腔注射VCR(0.1 mg/kg)或NS 10天后,急性分离结肠肌间神经元并体外培养6天,结果显示,VCR导致神经元的数目及轴突长度下降。通过GITT检测发现,注射VCR后肠道运动功能明显减慢。2.VCR调节结肠巨噬细胞极化与对照组相比,小鼠腹腔注射VCR后,CD86+促炎型巨噬细胞比例明显增多,CD206+抑炎型巨噬细胞比例略有减少。检测结肠LMMP中炎症因子的变化,结果显示,与对照组相比,VCR注射后,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA以及蛋白表达均明显增加,抑炎因子Arg1与Il-10的mRNA表达有降低趋势。以上结果表明,VCR可促进结肠巨噬细胞向促炎型极化。3.巨噬细胞在VCR导致结肠肌间神经元损伤中的作用使用氯膦酸二钠脂质体以维持VCR注射期间巨噬细胞的持续清除状态,结果显示,清除巨噬细胞可以明显减轻VCR导致的肠神经元数目减少和轴突损伤,降低VCR引起的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA和蛋白表达的增加,并改善肠道运动。4.VCR在RAW264.7巨噬细胞M1型极化中的作用及机制将10-10 M、10-9M、10-8M三个浓度的VCR刺激RAW264.7巨噬细胞24h后,检测促炎因子Il-1β、Il-6mRNA的表达,结果显示,三个浓度的VCR均可刺激RAW264.7巨噬细胞向M1型极化,但10-9M的VCR有更强的作用效果。而且,VCR(10-9 M)可以增强LPS的作用,诱导细胞产生更多的促炎因子。通过使用Western blot的方法,表明VCR可以通过促进ERK1/2和P38-MAPK的磷酸化,参与调控巨噬细胞向M1型极化。5.VCR通过促进巨噬细胞炎症因子的分泌导致结肠肌间神经元损伤将不同条件刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生的上清液收集作为条件培养基,用来孵育结肠肌间神经元。结果显示,与对照组相比,VCR刺激巨噬细胞产生的上清液孵育的结肠肌间神经元数目和轴突长度均明显下降。6.VCR诱导的促炎型巨噬细胞通过SGK1-FOXO3通路导致结肠肌间神经元损伤将VCR注射期间有/无巨噬细胞清除的LMMP进行转录组测序,分析其差异基因,并通过qRT-PCR进行验证。检测LMMP裂解液中SGK1和FOXO3蛋白及其磷酸化水平,结果显示,VCR诱导的促炎型巨噬细胞通过降低SGK1、p-SGK1和p-FOXO3/FOXO3的表达导致结肠肌间神经元损伤。7.VCR诱导的促炎型巨噬细胞加速结肠肌间神经元凋亡与对照组相比,VCR组神经节区域里TUNEL 阳性的神经元的数目显著增加,LMMP裂解液中Cleaved caspase-3的表达水平增加,巨噬细胞清除后VCR导致的肠神经元凋亡减少。8.巨噬细胞MAPK通路在VCR导致结肠肌间神经元损伤中的作用(1)MAPK通路抑制剂降低巨噬细胞促炎因子的分泌使用 PD98059(20μM)和 SB203580(10 μM)预处理 RAW264.7 巨噬细胞 1h,分别抑制ERK1/2和P38-MAPK通路的激活,再用VCR(10-9 M)和/或LPS(100 ng/ml)刺激细胞24 h,检测Il-6 mRNA的表达。结果显示,与无抑制剂组相比,抑制剂的使用显著降低了各组Il-6 mRNA的表达。(2)抑制巨噬细胞MAPK通路缓解VCR导致的结肠肌间神经元损伤将两种抑制剂预孵育小鼠腹腔巨噬细胞后,再用VCR(10-9 M)刺激细胞,去除残余药物后产生的上清液作为条件培养基,孵育结肠肌间神经元。结果显示,与VCR组相比,经抑制剂预处理的巨噬细胞上清液孵育的神经元数目和轴突长度均明显增加。抑制巨噬细胞ERK1/2和P38-MAPK通路后,巨噬细胞促炎因子分泌减少,减弱了 VCR对肠神经元SGK1-FOXO3信号通路的抑制,肌间神经元凋亡减少。9.OT抑制VCR诱导的巨噬细胞促炎型极化(1)在体外,OT抑制VCR诱导的RAW264.7巨噬细胞促炎型极化用 10-10M、10-9 M、10-8M、10-7M、10-6M 五个浓度的 OT 预孵育 RAW264.7 巨噬细胞lh,然后用VCR(10-9M)刺激细胞24h,检测Il-1β和Il-6mRNA的表达。结果显示,10-8 M、10-7M、10-6 M OT均可抑制VCR导致的巨噬细胞促炎型极化。(2)在体内,OT抑制VCR诱导的结肠巨噬细胞促炎型极化小鼠腹腔注射OT(1mg/kg)或NS1h后,再注射VCR(0.1 mg/kg)或NS,连续10天,检测LMMP中促炎因子的表达。结果显示,与VCR组相比,OT预处理组Il-1β、Il-6 mRNA的表达明显降低,说明OT抑制VCR诱导的巨噬细胞促炎型极化。10.OT缓解VCR导致的结肠肌间神经元损伤小鼠每天腹腔注射OT(1 mg/kg)或NS 1 h后,再注射VCR(0.1 mg/kg)或NS,连续10天,检测神经节区域里神经元的密度。结果显示,与VCR组相比,OT预处理组神经节区域里神经元的数目明显增加,证明OT缓解了 VCR导致的结肠肌间神经元损伤。11.OT缓解VCR导致的结肠肌间神经元损伤的机制小鼠腹腔注射OT(1mg/kg)或NS1h后,再注射VCR(0.1 mg/kg)或NS,连续10天。结果显示,与VCR组相比,OT预处理组P44/42和P38磷酸化蛋白以及Cleaved caspase-3蛋白表达明显降低,SGK1以及p-SGK1蛋白的表达增加,p-FOX03/FOX03的比例升高。研究结论VCR可以通过ERK1/2、P38-MAPK信号通路诱导巨噬细胞向促炎型极化,促进炎症因子的分泌,继而通过肠神经元内SGK1-FOXO3通路导致结肠肌间神经元损伤;OT通过ERK1/2、P38-MAPK信号通路抑制VCR诱导的巨噬细胞促炎型极化,通过肠神经元内SGK1-FOXO3通路对结肠肌间神经元发挥保护作用。第二部分缩宫素在衰老导致的肠神经及神经前体细胞损伤中的作用及机制研究研究目的已有文献报道,衰老导致血浆OT水平下降及成熟肠神经元损伤,而OT对衰老导致的肠神经及ENPCs损伤的作用及机制目前尚未有报道。本部分通过使用自然衰老的小鼠模型,探究衰老导致的肠神经及ENPCs损伤的机制,并通过给予外源性OT,探究OT在其中的作用。研究方法1.动物模型的制备青年鼠/老年鼠腹腔注射NS或OT(1 mg/kg),连续14天。在抑制肠胶质细胞(Entericgliacells,EGCs)功能的实验中,老年鼠腹腔注射OT的同时,每天需腹腔注射氟代柠檬酸盐(Fluorocitrate,FC,10 μM/kg),连续 14 天。2.小鼠结肠ENPCs分离与培养通过使用解剖器械依次去除小鼠结肠黏膜、黏膜下层、环形肌和浆膜,制备纵行肌-肌间神经丛(Longitudinal musclGW4869化学结构e myenteric plexus,LMMP)标本。LMMP 标本通过 45 min木瓜蛋白酶(10 mg/ml)、40 min胶原酶Ⅱ(1 mg/ml)的消化,体外分离并培养肌间 ENPCs。3.小鼠LMMP上清液条件培养结肠ENPCs体外培养老年鼠结肠LMMP,收集不同药物刺激LMMP产生的上清液作为条件培养基,加入刚分离的老年鼠结肠ENPCs中继续培养6天,观察ENPCs生长情况。4.采用H2O2构建EGCCRL2690细胞衰老模型,并通过MTT检测细胞活性,通过β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老比例。5.采用免疫荧光技术检测βⅢ-Tubulin+神经元、Nestin+ENPCs数目变化及EGCsp-ERK表达水平。6.采用Nestin-Cre:tdTomato小鼠和EdU染色检测ENPCs的增殖情况。7.采用qRT-PCR技术检测结肠LMMP及EGC CRL2690细胞中衰老相关标志物、OT-OTR信号通路、EGCs相关分子的mRNA表达情况。8.采用ELISA检测结肠组织匀浆中OT、GDNF蛋白浓度的变化。9.采用Western blot检测结肠LMMP中P16、Nestin、RET、PI3K、AKT蛋白的表达情况。10.采用结肠排珠实验检测结肠的运动功能。研究结果1.外源性OT缓解结肠衰老检测结肠衰老相关标志物的表达,结果显示,与青年鼠相比,老年鼠结肠衰老相关标志物 P16 和衰老相关分泌表型(Senescence associated secretory phenotype,SASP)的表达增加,而外源性OT能够降低老年鼠P16和SASP的表达。2.OT-OTR信号系统在衰老结肠中的作用检测结肠OTR和OT的表达,结果显示,与青年鼠相比,老年鼠结肠OT、OTR表达降低,而外源性OT可以增加老年鼠结肠OT和OTR的表达。3.OT缓解衰老导致的ENS结构和功能损伤检测结肠肌间神经丛神经节区域里神经元与Nestin+ENPCs的密度及结肠的运动功能。结果显示,与青年鼠相比,老年鼠神经节区域里神经元和ENPCs数目减少,结肠运动减慢,而外源性OT明显增加老年鼠结Oncology research肠肌间神经元及ENPCs数目,改善衰老导致的结肠运动功能障碍。4.OT通过EGCs缓解衰老导致的结肠肌间神经元和ENPCs损伤(1)EGCs 表达 OTR结肠肌间神经丛内胶质细胞标志物GFAP与OTR可以共定位,表明EGCs表达OTR。(2)OT对衰老EGCs及GDNF的作用检测结肠GFAP和GDNF的表达,结果显示,与青年鼠相比,老年鼠结肠GFAP、GDNF表达下降,而外源性OT能明显提高老年鼠结肠中GFAP、GDNF的表达。(3)OT通过ERK通路参与调节衰老EGCs检测结肠肌间EGCs中p-ERK的表达,结果显示,与青年鼠相比,老年鼠结肠肌间GFAP+ EGCs的p-ERK表达减少;外源性OT能够增加老年鼠GFAP+EGCs的p-ERK表达。提示OT通过激活ERK信号通路参与调节衰老EGCs GDNF的表达。(4)FC抑制OT对衰老导致的结肠肌间神经元和ENPCs损伤的保护作用老年鼠每日腹腔注射OT的同时注射FC(10 μM/kg),连续14天。检测结肠GFAP和GDNF的表达,结果显示,与注射OT的老年鼠相比,注射FC和OT的老年鼠结肠GFAP的表达无明显变化,但GDNF表达下降,说明FC的使用抑制了 EGCs的功能,GDNF产生减少。检测结肠肌间神经丛神经节区域里神经元及ENPCs的密度,结果显示,与注射OT的老年鼠相比,注射FC和OT的老年鼠神经节区域里神经元及ENPCs的数目均下降。5.OT在H2O2诱导的EGC CRL2690细胞衰老模型中的作用(1)正常培养条件下OT对EGC CRL2690细胞的作用EGCCRL2690细胞在正常条件下培养,用不同浓度(10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6 M)的OT孵育2h后,检测Otr、Gdnf mRNA的表达。结果显示,10-10 M、10-9 M、10-8 M OT孵育会使EGCs Otr的表达降低,但均不会对Gdnf的表达产生影响。(2)H2O2诱导衰老条件下OT对EGC CRL2690细胞的作用用不同浓度(0 μM、1 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μM)的H2O2刺激细胞8 h,以诱导EGC CRL2690细胞衰老。使用MTT检测不同H2O2浓度下细胞的活性,结果显示,25 μM的H2O2作用效果最优,且该浓度的H2O2可以诱导EGCs衰老。用不同浓度(10-9M、10-8M、10-7M、10-6 M)的OT预孵育细胞2h,接着用25μM H2O2刺激细胞8h,检测Gdnf、SASPmRNA的表达。结果显示,10-8M OT可以明显提高EGCs Gdnf的表达,并降低SASP的表达。6.OT通过GDNF-RET-PI3K-AKT通路缓解衰老导致的结肠肌间神经元和ENPCs损伤(1)Nestin+ENPCs在体外快速增殖从Nestin-Cre:tdTomato小鼠结肠分离得到Nestin+ENPCs,并体外培养6天,观察ENPCs随时间的变化,结果显示ENPCs在体外可以快速增殖。将野生小鼠分离出的ENPCs进行EdU及Nestin染色,结果显示,Nestin+ENPCs中有高达93.11± 1.52%的细胞显示EdU阳性,证明分离得到的Nestin+ENPCs在体外具有增殖潜能。(2)GDNF-RET在OT缓解衰老导致的ENPCs损伤中的作用将有/无OT(10-8M)处理的老年鼠LMMP产生的上清液作为条件培养基,培养老年鼠结肠ENPCs 6天,并在培养ENPCs时加入RET抑制剂BLU667(10 nM),观察ENPCs的体外增殖情况。结果显示,RET抑制剂的加入抑制了 OT促进ENPCs增殖的作用。(3)OT诱导产生的GDNF通过RET-PI3K-AKT通路缓解衰老导致的ENPCs损伤检测LMMP组织裂解液中RET蛋白、PI3K和AKT蛋白及其磷酸化水平。结果显示,OT处理明显增加了老年鼠RET蛋白以及PI3K和AKT磷酸化蛋白的表达。研究结论衰老导致结肠肌间神经元及ENPCs损伤,肠道运动功能异常。外源性OT可以通过ERK通路促进衰老EGCs GDNF的表达,GDNF与ENPCs表面RET受体结合激活PI3K-AKT通路,从而缓解衰老导致的ENPCs损伤。