目的:5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是近几十年临床最常使用的抗代谢类化疗药物之一,肝肾毒性是其常见的不良反应。这很大程度上限制了5-FU在临床上的应用。目前研究表明5-FU通过诱导细胞凋亡、炎症反应、氧化应激和脂质过氧化等途径引起肝肾损伤,但是具体作用机制尚不明确。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是一种主要由肝脏分泌的蛋白,在维持机体糖脂代谢平衡方面具有重要作用。目前研究表明FGF21能够改善细胞自噬下降、内质网应激、线粒体功能障碍和氧化应激等导致的肝脏损伤。另一方面,FGF21是肝脏参与器官间交流的重要调节因子。研究表明伴有肾功能下降的慢性肾病患者、长期透析的患者和急性肾损伤的患者循环系统中FGF21的含量明显升高。但肝源性FGF21对肾脏功能的影响及在肾脏疾病中的作用机制尚不明确。本研究通过给予小鼠5-FU腹腔注射构建小鼠肝肾损伤模型,证明了5-FU引起的肝肾损伤可能与铁死亡相关,探究了FGF21对5-FU引起的肝肾损伤的影响及其机制。同时本研究探究了在这种病理状态下,是否存在以FGF21为介质的肝肾器官交流。研究方法:本研究第Vorinostat体内实验剂量一部分通过给予野生型C57BL/6J小鼠腹腔注射5-FU的方法构建小鼠肝脏、肾脏损伤模型。实验结束后收集小鼠血清、肝脏与肾脏组织,检测与铁死亡相关的各项指标,探究5-FU引起小鼠肝脏、肾脏损伤的机制。并通过5-FU处理HK-2细胞构建体外5-FU引起肾小管细胞损伤模型,进一步验证5-FU引起肾损伤的机制。本研究第二部分通过FGF21全身性敲除小鼠与野生型小鼠进行比较,探究FGF21对5-FU引起的肝脏组织铁死亡的影响及机制。并通过尾静脉注射腺病毒的方法使小鼠肝脏组织过表达FGF21,进一步验证FGF21对5-FU引起的肝脏组织铁死亡的影响及机制。本研究第三部分通过FGF21全身性敲除小鼠与野生型小鼠进行比较,探究FGF21对5-FU引起的肾脏组织铁死亡的影响及机制。并通过尾静脉注射腺病毒的方法使小鼠肝脏组织过表达FGF21和使用FGF21肝脏特异性敲除小鼠,验证肝源性FGF21对5-FU引起的肾脏组织铁死亡的影响及肝肾之间存在FGF21为介质的器官交流。1、观察小鼠体重、肝脏和肾脏的大体形态以及肝脏和肾脏器官指数的变化。2、采用H&E染色和PAS染色分别检测小鼠肝脏和肾脏的病理学改变。3、采用血清ALT、AST检测试剂盒检测小鼠肝功能的变化。采用血清肌酐、BUN检测试剂盒检测小鼠肾功能的变化。4、采用血清铁含量测定试剂盒检测小鼠血清中铁含量。采用组织铁检测试剂盒检测小鼠肝脏和肾脏组织中的铁含量。5、采用quantitative RT-PCR实验检测小鼠肝脏及肾脏组织中铁代谢和铁死亡相关基因m RNA水平的表达。采用Western blot实验检测小鼠肝脏及肾脏组织中铁代谢和铁死亡相关蛋白表达变化。6、采用二氢乙锭(dihydrogen ethidium,DHE)超氧化物阴离子荧光探针检测肝脏及肾脏组织ROS水平。7、采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)实验检测肝脏及肾脏组织中脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)表达变化。8、采用试剂盒检测肝脏及肾脏组织脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量变化。9、采用试剂盒检测HK-2细胞内铁含量。10、采用quantitative RT-PCR实验检测HK-2细胞中铁代谢和铁死亡相关基因m RNA水平的表达变化。采用Western blot实验检测HK-2细胞中铁代谢和铁死亡相关蛋白表达的变化。11、采用试剂盒检测HK-2细胞中MDA和GSH含量。12、使用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)、去铁胺(deferoxamine,DFO)、GSH、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理细胞后给予细胞5-FU(100μM,24 h)处理,采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)探针法检测细胞ROS的水平,采用CCK8检测法测定HK-2细胞的存活率。13、使用Fer-1预处理细胞后给予5-FU(100μM,24 h)处理细胞,采用试剂盒检测细胞MDA含量变化,采用Western blot实验检测细胞铁代谢和铁死亡相关蛋白表达变化。14、采用普鲁士蓝染色检测肝脏组织中的铁颗粒沉积。15、采用细胞免疫共沉淀技术验证FGF21与HO-1在蛋白水平相互作用。16、采用TUNEL染色检测肝脏组织中凋亡小体的数量。结果:第一部分:1、5-FU处理引起小鼠体重下降,肝功能受损。2、5-FU处理引起小鼠肝脏组织铁蓄积。3、5-FU处理引起小鼠肝脏组织ROS含量增加,GSH含量下降,脂质过氧化产物MDA和4-HNE蓄积。4、5-FU处理引起小鼠肾脏组织肾小管囊性扩张,肾小球鲍曼囊面积减小,肾小球血管簇面积减小,囊间隙增宽和肾脏功能下降。5、5-FU处理引起小鼠肾脏组织非铁蛋白结合铁摄入增多,铁自噬增强导致肾脏组织铁含量增加。6、5-FU处理引起小鼠肾脏组织ROS含量增加,GSH含量下降,NRF2及其下游抗氧化因子表达下降。7、5-FU处理引起小鼠肾脏组织脂质过氧化产物MDA及4-HNE含量增加,酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)表达升高。8、5-FU处理引起HK-2细胞内铁蓄积。9、5-FU处理引起HK-2细胞内胱氨酸/谷氨酸反向转运体表达下降,GSH含量下降,脂质过氧化产物MDA含量升高。10、Fer-1、DFO、GSH和NAC预处理改善5-FU引起的HK-2细胞ROS水平升高和细胞活力降低。11、Fer-1预处理改善5-FU引起的HK-2细胞MDA含量增多。12、Fer-1预处理改善5-FU引起的HK-2铁代谢和铁死亡相关蛋白表达变化。第二部分:1、FGF21缺失加重5-FU引起的小鼠体重和进食量的下降。2、FGF21缺失加重5-FU引起的小鼠肝脏组织脏器指数的下降、肝脏细胞凋亡和肝功能下降。3、FGF21缺失加重5-FU处理引起的小鼠肝脏组织铁摄入增多,铁自噬增强导致肝脏组织铁含量进一步增加。4、FGF21缺失加重5-FU处理引起的肝脏组织ROS含量增加,GSH含量下降。5、FGF21缺失加重5-FU处理引起的肝脏组织脂质过氧化产物MDA和4-HNE的蓄积。6、肝脏过表达FGF21未能改善5-FU引起的小鼠体重和进食量的下降。7、肝脏过表达FGF21改善5-FU引起的小鼠肝脏脏器指数下降和肝功能受损。8、肝脏过表达FGF21改善5-FU引起的小鼠肝脏组织铁摄入增多导致的铁含量增加。9、肝脏过表达FGF21改善5-FU引起的小鼠肝脏组织ROS含量增多和脂质过氧化产物MDA含量增多。10、FGF21改善5-FU引起的小鼠肝脏组织HO-1过表达。11、FGF21与HO-1在蛋白水平相互作用。第三部分:1、FGF21缺失加重5-FU处理引起的小鼠肾脏组织肾小球血管簇面积减小,囊间隙增宽和肾功能下降。2、FGF21缺失加重5-FU处理引起的小鼠肾脏组织非铁蛋白结合铁摄入增多和铁自噬增强导致的肾脏组织铁含量增加。3、FGF21缺失加重5-FU处理引起的小鼠肾脏组织ROS含量增加,GSH含量下降以及NRF2及其下游抗氧化因子表达下Berzosertib溶解度降。4、FGF21缺失加重5-FU处理引起的小鼠肾脏组织脂质过氧化产物MDA和4-HNE含量增加以及ACSPHHs primary human hepatocytesL4表达升高。5、小鼠肝脏组织过表达FGF21改善5-FU处理引起的肾脏组织鲍曼囊面积减小,肾小球血管簇面积减小和囊间隙增宽。6、小鼠肝脏组织过表达FGF21改善5-FU处理引起的小鼠肾脏组织非铁蛋白结合铁摄入增多,铁自噬增强导致的肾脏组织铁含量增加。7、小鼠肝脏组织过表达FGF21改善5-FU处理引起的小鼠肾脏组织ROS含量增加,GSH含量下降以及NRF2及其下游抗氧化因子表达下降。8、5-FU引起肝脏特异性FGF21敲除小鼠肾脏组织的病理学改变与FGF21全身性敲除小鼠更为接近,较野生型小鼠更为严重。9、5-FU处理后,肝脏特异性FGF21敲除小鼠肾脏组织的铁蓄积程度与FGF21全身性敲除小鼠更为接近,较野生型小鼠更为严重。10、肝脏特异性FGF21敲除小鼠与FGF21全身性敲除小鼠肾脏组织中NRF2及其下游抗氧化因子表达下降,在5-FU处理后下降更为明显。结论:铁死亡可能是5-FU引起的肝肾损伤的治疗靶点。FGF21是一种铁死亡调节剂,对铁死亡相关的组织损伤具有保护作用。肝源性FGF21调节肝肾交流改善5-FU引起的肾损伤。