G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是人体内最大的膜蛋白受体超家族,介导着非常多且重要的生理功能,也是最重要的药物研发靶标。目前经FDA批准上市的药物中,超过35%的药物靶向GPCRs,其中A类GPCRs是最受欢迎的药物靶标。但在靶向A类GPCRs的药物中,约75%的药物以胺能受体为靶点,使得该靶点的药物研发处于过饱和状态,另外仅有10%左右的药物以肽类受体为靶点,为了进一步扩大新药市场,新靶点的确认和开发迫在眉睫。因此,我们选择A类GPCRs中Canagliflozin的两种肽类受体,识别环状多肽的生长抑素受体SSTR4和识别线性多肽的神经调节肽受体NMU2进行结构生物学研究,旨在阐明不同种肽类受体的配体识别和选择性机制,为该类受体的靶点开发和药物研究提供结构信息。生长抑素受体4(somatostatin receptors 4,SSTR4)属于SSTRs中的一员,与SSTRs家族中的其它成员相比,SSTR4特异性地分布于中枢神经系统的下丘脑、大脑皮层和纹状体等,参与调控学习、记忆功能、疼痛和炎症相关通路,成为开发非阿片类镇痛/抗炎药物的新靶点。目前已有靶向SSTRs的药物上市,但所有的药物分子对SSTR4的亲和力S63845研究购买特别低。因此本课题以SSTR4为主要研究对象,对SSTR4与不同种类的配体和下游效应蛋白的复合物展开研究。利用昆虫细胞表达系统进行表达载体筛选、G蛋白种类筛选、纯化步骤和纯化条件筛选以及相关抗体测试,得到了满足单颗粒冷冻电镜(cryo-electronic microscopy,cryo-EM)实验需求的复合物样品。通过对冷冻电镜的制样条件进行筛选,冷冻电镜数据收集与处理,最终得到了分别率分别为2.9(?)和2.8(?)的内源性多肽激动剂SST-14和小分子选择性激动剂J-2156与SSTR4–G_(i1)复合物的结构模型。我们通过与实验室同期解析的SST-14与SSTR2–G_(i1)复合物的结构比较,阐述了多肽环状激动剂SST-14在结合不同受体亚型时保守的和特异性的配体识别机制。SST-14的关键药理学中心在SSTR2和SSTR4中采取了相似的结合构象并具有相似的相互作用模式,但在关键药理学中心之外的氨基酸与受体的相互作用模式存在巨大差异。该差异由SSTR2和SSTR4的序列和结构特异性导致,SSImmune changesT-14的灵活构象使其能够对不同的受体保有同等的高亲和力。由于根据SST-14改造而来的药物分子构象受到限制,使其只能选择性地结合一种或几种受体,从而导致了配体选择性。SSTR4与小分子激动剂J-2156的结构显示在SSTR4中存在一个特异性的亚结合口袋,靶向该亚结合口袋进行新型的药物设计则有望提高配体对SSTR4的识别和选择性。神经调节肽U受体2(neuromedin U receptor 2,NMU2)属于A类GPCRs神经肽类受体中的一员,与同家族受体NMU1广泛表达于外周组织中不同的是,NMU2偏向于在人体大脑内的特定区域表达,特别是下丘脑,延髓和垂体等。有研究表明NMU2的激活可以显著抑制小鼠的进食行为并降低小鼠体重,而抑制NMU2的功能则会使小鼠体重增加,因此NMU2作为新的治疗肥胖的靶点得到广泛关注。但由于NMU2相关配体研究比较滞后,阻碍了NMU2进一步的功能研究和药物发现。因此我们以NMU2为主要研究对象,对NMU2的表达载体进行了大量筛选和优化,对已有的NMU2的配体进行了测试,并对NMU2与选择性拮抗剂EX9657和R-PSOP进行多次大量结晶实验,但并未得到复合物晶体。后续我们利用已解析的Nm U-25和NMU2–G_(i1)复合物的结构模型对选择性拮抗剂R-PSOP进行分子对接试验。分子对接实验结果表明,R-PSOP位于NMU2配体结合口袋的最底部,与NMU2形成关键的极性和疏水相互作用,除此之外,R-PSOP与NMU2的第三根和第四根跨膜螺旋之间形成的疏水口袋也有紧密的疏水相互作用。我们利用磷酸肌醇累积实验对R-PSOP的结合模式进行功能验证发现,该疏水口袋是决定R-PSOP受体选择性的关键所在。这些结构信息揭示了R-PSOP的受体选择性机制,同时为设计靶向NMU2的选择性配体提供了新的思路。SSTR4和NMU2与内源性配体和选择性配体的结构模型进一步增加了我们对肽类受体的配体识别机制和选择性机制的认识,为以结构为基础的药物设计提供了可靠的结构模型,进一步促进靶向肽类受体的药物研发。