研究背景脓毒症是急诊科常见且高病死率的疾病,发病早期单核巨噬细胞活化并释放炎症因子,募集中性粒细胞形成胞外陷阱网捕获并杀死病原菌。炎症过激时免疫细胞大量死亡并释放损伤相关分子模式导致多脏器功能障碍,是脓毒症早期死亡的重要原因;大量免疫细胞死亡还引发持续免疫抑制,继发二次感染是中后期的主要死因。近年,细胞因子风暴的治疗措施降低了脓毒症早期病死率,但临床尚缺乏干预免疫细胞死亡的有效方法。第一部分 脓毒症早期临床特征和预后危险因素的分析研究目的建立脓毒症单病种数据库,分析不同预后组患者疾病早期临床特征的差异,筛选不良预后的独立危险因素,重点关注免疫细胞数量变化与患者预后的相关性,为疾病早期精准评估脓毒症病情和预后提供依据。研究方法获取伦理审批,制定受试者纳入和排除标准,采集入组患者临床数据,包括生理指标、感染部位、检验结果、疾病评分和90 d预后情况。采用Luminex和ELISA技术检测患者血浆内炎症因子、趋化因子、细胞凋亡和焦亡分子的含量。比较不同预后组患者疾病早期临床特征的差异,Logisitic和COX回归分析死亡的独立危险因素,最后借助受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)评估临床指标的预测效能。研究结果(1)与存活FUT-175半抑制浓度组相比,脓毒症死亡患者疾病早期外周单核细胞计数和百分比均显著降低,SOFA 评分(Sequential Organ Failure Assessment)、入室心率、呼吸频率、血浆中乳酸、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量均显著升高。(2)Logisitic和COX回归分析均提示脓毒症早期单核细胞比例降低和血乳酸升高是不良预后的独立危险因素;ROC曲线提示单核细胞比例的预测效能较好。(3)脓毒症时血浆炎症因子(TNF-α)、趋化因子(CCL2)、凋亡分子(BAX)和焦亡分子(GSDMD)均升高,抗凋亡分子(BCL2)降低,死亡组变化均更显著。研究结论疾病早期外周单核细胞比例降低和乳酸水平升高是脓毒症患者死亡的独立危险因素,死亡组患者血浆内凋亡和焦亡分子含量较存活组和健康组均显著增高。第二部分PBMCs高通量测序揭示脓毒症早期免疫细胞主要死亡模式研究目的基于脓毒症早期患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)高通量测序,分析不同类型免疫细胞主要死亡模式及其与预后的相关性。研究方法健康者、存活组和死亡组患者PBMCs进行转录组测序,筛选组间差异基因并进行功能富集,重点探究免疫细胞死亡信号通路的变化。qRT-PCR和Western blotting验证差异基因转录和翻译水平的表达情况;电镜观察不同预后组免疫细胞的形态和结构;流式细胞计数分析免疫细胞凋亡和坏死比例并比较组间差异。单细胞测序(sc-RNA seq)揭示脓毒症早期不同类型免疫细胞的主要死亡模式,重点关注参与固有免疫反应的单核细胞和中性粒细胞。研究结果(1)转录组测序提示脓毒症患者PBMCs较健康组的差异基因在细胞凋亡信号通路中富集,凋亡焦亡分子(BID和CASP4/5)上调,抑凋亡基因BCL2下调,死亡组变化更显著。(2)与存活组比较,死亡组患者免疫细胞凋亡和坏死比例显著增高;细胞核皱缩和异染色质边集征象明显;胞内凋亡分子(BAX和Caspase3)显著增多,抗凋亡分子BCL2减少。(3)单细胞测序显示脓毒症早期免疫细胞的差异基因在不同死亡信号通路中均有富集。中性粒细胞在坏死、坏死性凋亡和焦亡信号通路中最显著;单核细胞在凋亡、自噬和铁死亡中最显著。研究结论脓毒症早期外周免疫细胞内凋亡分子上调、凋亡信号通路显著激活、凋亡比例增高并呈现典型凋亡形态学变化,且死亡组更显著;单细胞测序揭示脓毒症时单核细胞内凋亡信号通路变化较显著。第三部分肝脏枯否细胞凋亡与脓毒症病情严重程度此网站的相关性研究目的通过细胞实验和动物实验,探索脓毒症时组织巨噬细胞(肝脏枯否细胞)的凋亡情况及其与病情严重程度的相关性。研究方法采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,200 ng/ml)处理小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞开展体外实验,分析脓毒症时巨噬细胞的凋亡情况。流式细胞计数分析细胞的凋亡率;透射电镜分析细胞形态和结构的变化;qRT-PCR和Western blotting检测不同处理组凋亡基因转录和翻译水平的变化。利用雄性C57BL/6小鼠构建脓毒症动物模型,分为假手术组和疾病组,疾病组(轻症和重症)进行盲肠结扎穿刺(Cecum Ligation and Puncture,CLP)。术后观察小鼠一般状态并进行疾病评分,24 h处死并采样。Luminex和ELISA检测小鼠血浆内炎性因子和凋亡分子含量;肝肺组织切片苏木精-伊红(HE)染色并进行病理评分;免疫荧光染色分析枯否细胞的凋亡率;qRT-PCR和Western blotting检测肝组织中凋亡分子的表达变化。研究结果(1)LPS处理后RAW264.7细胞的凋亡比例显著升高;胞核内异染色质边集,核周间隙增宽;胞内凋亡分子BAX和Caspase3显著上调,抗凋亡基因BCL2下调。(2)CLP术后小鼠毛发蓬松,活动减少,疾病评分显著增高;肝肺组织炎性浸润和细胞凋亡显著增多;肝组织细胞内凋亡基因(BAX和Caspase3)显著升高,抗凋亡基因BCL2降低。(3)与轻症组比较,重症组小鼠血浆炎症分子(TNF-α、IL-6)、凋亡分子(BAX)和肝酶(ALT和AST)含量均上调,且枯否细胞凋亡率显著增高。研究结论脓毒症时肝脏巨噬(枯否)细胞凋亡显著增多,且与病情严重程度相关。第四部分ADAR1抑制巨噬细胞过度凋亡改善脓毒症预后的调控机制研究目的基于测序结果和课题组前期双链RNA腺苷脱氨酶1(Adenosine deaminase RNA 1,ADAR1)研究基础,深入探讨巨噬细胞凋亡的调控机制,寻找新的干预靶点。研究方法软件预测结合位点并进行核糖核蛋白-免疫共沉淀(RNP-IP)实验,分析ADAR1与miRNA-122直接结合并进行Ato I编辑;双萤光素酶实验探究miRNA-122与BCL2A1的靶向关系。使用ADAR1腺病毒、ADAR1特异性小干扰RNA(si-ADAR1)转染RAW 264.7细胞,特异性过表达或敲除ADAR1;使用miRNA-122 mimic、miRNA-122 inhibitor转染细胞,过表达或抑制miRNA-122。流式细胞计数分析转染后细胞的凋亡比例;透射电镜观察不同处理组细胞形态和结构的变化;免疫荧光标记分析细胞内凋亡分子的表达量;qRT-PCR和Western blotting分别检测ADAR1、miRNA-122、BAX、BCL2A1a在转录和翻译水平的表达变化。最后,通过动物实验验证ADAR1/miRNA-122/BCL2A1调控巨噬细胞凋亡影响脓毒症小鼠预后的机制,治疗组(CLP+OE-ADAR1)小鼠CLP术后经尾静脉注射ADAR1腺病毒。研究结果(1)抑制ADAR1后,RAW264.7细胞内凋亡分子(BAX和Caspase3)上调,BCL2A1a下调,凋亡率显著增高,可见典型凋亡形态;过表达ADAR1呈相反变化。(2)RNP-IP证实ADAR1Streptococcal infection结合并编辑miRNA-122;双萤光素酶报告提示miRNA-122靶向调控BCL2A1,过表达miRNA-122,BCL2A1a显著降低,细胞凋亡率增高,抑制 miRNA-122 时 BCL2A1a 升高。(3)ADAR1 通过 miRNA-122/BCL2A1 通路,降低枯否细胞凋亡减轻肝脏损伤,提高CLP小鼠存活率。研究结论ADAR1可通过miRNA-122/BCL2A1通路抑制枯否细胞凋亡,减轻肝脏损伤,提高脓毒症存活率。综上,临床调查发现脓毒症早期单核细胞减少是不良预后的危险因素,高通量测序提示脓毒症时单核细胞凋亡增多,死亡组更显著。动物和细胞实验证实脓毒症早期巨噬(枯否)细胞凋亡增多,且与病情严重程度相关,并揭示ADAR1可通过miR-122/BCL2Al信号通路抑制枯否细胞过度凋亡,减轻肝损伤降低病死率。总之,本研究证实脓毒症早期单核巨噬细胞凋亡与预后相关,并找到新的干预靶点。