紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种重要的豆科牧草,具有营养价值高、适应性强、产量高、适口性好等优良特性,因此在世界范围内广泛种植。木质素是植物细胞壁的组成成分之一,为植物提供机械支撑,且有利于植物抵御外界不良环境,但木质素不能被家畜吸收,会降低牧草消化率。因此,培育低木质素紫花苜蓿品种一直以来都是紫花苜蓿品质改良的热点之一。由于紫花苜蓿是高度杂合的同源四倍体,自交不亲和,基因组复杂,所以分子育种具有一定难度。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的基因组和紫花苜蓿高度同源AZD2281价格,通过研究蒺藜苜蓿的基因功能可以为紫花苜蓿分子育种提供较高的参考价值。本研究克隆了蒺藜苜蓿Mt MYB17基因,对其进行序列分析、表达模式分析和亚细胞定位,将Mt MYB17转入蒺藜苜蓿获得过表达株系,通过生理测定、组学分析、分子生物学方法解析了Mt MYB17抑制木质素和类黄酮合成的分子机制;同时克隆出Mt MYB17在紫花苜蓿中的同源基因Ms MYB17,并将其过表达至紫花苜蓿,进行表型鉴定,以期获得低木质素的紫花苜蓿育种新材料。本研究主要研究结果及结论如下:1.蒺藜苜蓿Mt MYB17基因属于R2R3-MYB家族第四亚族。对Mt MYB17进行组织特异性表达分析,结果表明其在根、茎、叶中均有表达,且在幼嫩茎中表达量最高,成熟茎中表达量最低。对Mt MYB17在干旱和盐胁迫下的表达分析发现,Mt MYB17受到干旱和盐胁迫的诱导表达,且在盐胁迫下表达量持续增高。对Mt MYB17蛋白进行亚细胞定位,结果显示其定位在细胞核,属于核蛋白。2.利用农杆菌介导的遗传转化法将Mt MYB17转入蒺藜苜蓿得到过表达阳性植株,对Mt MYB17的生物学功能进行探究,结果表明,过表达植株茎和叶的木质素含量显著降低,其中G型木质素和S型木质素含量均显著降低,叶片中类黄酮含量也显著降低,说明Mt MYB17抑制蒺藜苜蓿木质素和类黄酮的合成。3.通过对Mt MYB17过表达植株进行木质素靶向代谢组分析发现,过bone biomarkers表达株系中肉桂酸、香豆酸、阿魏酸含量显著下调。类黄酮靶向代谢组结果表明,过表达株系中19个代谢物含量发生变化,且在两个株系中变化趋势一致,即棉黄素-3-O-葡萄糖醛酸苷-8-O-葡萄糖苷等5个上调,3,9-二羟基紫檀素、紫檀素、荠苎黄酮、何首乌乙素等14个下调。由此可见,木质素和类黄酮总含量的变化与相关代谢物累积量的变化有关。4.通过对Mt MYB17过表达植株进行转录组分析发现,两个过表达株系共同差异基因有1278个,包括414个上调基因,863个下调基因。GO分析结果显示Mt MYB17对氨基酸、单糖、有机酸等分解代谢过程起正向调控作用,对苯丙烷生物合成和代谢、类黄酮生物合成和代谢、细胞壁合成等生物学过程起负向调控作用。KEGG分析结果显示,Mt MYB17对氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢途径起正向调控作用,对黄酮生物合成、次级代谢物生物合成、亚麻酸代谢、异黄酮生物合成、苯丙烷生物合成等途径起负向调控作用。富集在苯丙烷途径上的共同下调基因有23个,包括PAL、4CL、CCo AOMT等12个基因家族,说明Mt MYB17的过表达使这些苯丙烷途径基因的转录表达受到抑制。5.通过酵母单杂交试验发现,Mt MYB17可以与Mt PAL2、Mt4CL2、Mt4CL-L1KE1、Mt CCo AOMT1的启动子结合,且这四个基因在两个过表达株系中表达量均显著下调,说明Mt MYB17通过抑制Mt PAL2、Mt4CL2、Mt4CL-L1KE1、Mt CCo AOMT1的表达,从而负调控木质素和类黄酮的合成。另外,通过酵母双杂交筛库共筛选出101个潜在的与Mt MYB17蛋白具有互作关系的蛋白,对筛选出的Mtb HLH94、Mt CCR1、Mt NET1A蛋白进行回转验证,结果表明均与截短后的Mt MYB17蛋白有互作关系。6.紫花苜蓿Ms MYB17基因属于R2R3-MYB家族第四亚族。通过对Ms MYB17的表达模式分析发现,Ms MYB17在根、茎、叶中均有表达,且在幼嫩茎中表达量最高,在干旱和盐胁迫下表达量有所提高,但响应时间不持续。Ms MYB17蛋白定位于细胞核。通过农杆菌介导的遗传转化法将紫花苜蓿Ms MYB17基因分别转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)和紫花苜蓿中,Ms MYB17的过表达导致拟南芥和紫花苜蓿的木质素含量降低,拟南芥植株生长受到抑制,紫花苜蓿除了一个株系的生长没有受到影响外,其余三个株系的生长均受到抑制。另外,紫花苜蓿营养指标中粗蛋白、粗灰分、磷含量、钙含量显著升高,粗纤维、糖含量、中性洗涤纤维含量显著降低,酸性洗涤纤维一个株系显著升高,其他三个株系没有显著变化,相对饲喂价值一个株系显著升高、一个株系显著降低、两个株系没有显著变化。综上所述,Mt MYBwww.selleck.cn/products/erastin17的过表达降低了蒺藜苜蓿木质素和类黄酮含量,这与木质素和类黄酮相关代谢物累积量降低有关,Mt MYB17通过抑制Mt PAL2、Mt4CL2、Mt4CLL1KE1、Mt CCo AOMT1的转录表达对蒺藜苜蓿木质素和类黄酮的合成起负向调控作用。Ms MYB17的过表达降低了紫花苜蓿的木质素含量,得到了低木质素和高相对饲喂价值的紫花苜蓿育种新材料。