肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌病理类型,是癌症相关死亡的第三大原因。索拉非尼是第一个获批用于晚期HCC一线治疗的酪氨酸激酶抑制剂,可以延长患者的中位生存时间,但只能延长3-5个月,这在很大程度上归因于耐药性的产生。近年来,尽管索拉非尼与免疫治疗等联合应用在一定程度上改善了索拉非尼的耐药性,但不良副反应的叠加导致部分患者无法从中获益。因此,探索索拉非尼耐药预测标志物,筛选最佳获益人群,探索索拉非尼耐药潜在机制,开发联合用药新策略,对于改善晚期HCC患者的预后至关重要。机体的炎症状态与肿瘤治疗反应密切相关。全身炎症反应指数(Systemic inflammation response index,SIRI)是反应机体炎症状态的有效指标,对于预测肿瘤耐药性和生存预后越来越重要,但其在接受索拉非尼治疗的肝癌患者中的预测价值尚不清楚。Notch1信号通路的异常激活与肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关。在卵巢癌、乳腺癌的研究中还发现Notch1过表达会诱导上皮间充质BYL719体外转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT),从而导致肿瘤细胞对细胞毒性药物产生耐药性。但Notch1信号通路是否参与了HCC索拉非尼耐药的形成尚不清楚。苦参碱(Matrine)是从苦参的根皮中提取分离得到的一种生物碱,能抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,逆转多药耐药。前期研究也发现苦参碱可以通过抑制Notch1信号通路预防HCC的发生,并减轻肝损害。那么苦参碱与索拉非尼联用能否发挥增效减毒的作用,以及其潜在的作用机制有待进一步探索。在本研究中,首先评估了SIRI对HCC患者索拉非尼耐药及生存预后的预测能力,以探索新的预测标志物。第二,比较索拉非尼耐药HCC细胞与亲代HCC细胞中Notch1信号通路激活情况,并通过阻断Notch1信号通路,观察NoMolecular Diagnosticstch1信号通路是否参与了索拉非尼耐药的发生。第三,评估苦参碱联合索拉非尼能否逆转索拉非尼耐药,并进行机制探索。最后,建立裸鼠肝癌异种移植瘤模型,进行体内验证。第一部分全身炎症反应指数预测肝细胞癌索拉非尼耐药及生存预后目的:探讨SIRI对接受索拉非尼治疗的HCC患者索拉非尼耐药和生存预后的预测价值,筛选预测索拉非尼耐药和生存预后的有效生物标志物。方法:回顾性分析了在河北医科大学第四医院接受索拉非尼单药和/或免疫检查点抑制剂治疗的HCC患者352例。全身炎症反应指数(SIRI)通过血常规指标计算获得。通过ROC曲线确定最佳截断值。使用Cox比例风险模型确定独立预测因素。结果:1.基线高SIRI组患者的OS、PFS、ORR、DCR显著低于低SIRI组。治疗后SIRI升高组患者的OS、PFS明显减低。2.SIRI是PFS和OS的独立预测因素。3.高SIRI与肿瘤负荷高、肝脏储备能力差、一般体力状态差和疾病分期晚密切相关。4.SIRI与CD3+、CD4+和CD8+T细胞计数呈显著负相关。小结:SIRI是预测索拉非尼耐药和生存预后的潜在生物标志物,基线高SIRI和治疗后SIRI增高的患者更易发生索拉非尼耐药,预后不良。SIRI与淋巴细胞亚群密切相关,可用于无创评估肿瘤微环境中的免疫炎症反应,并预测索拉非尼治疗疗效。对于SIRI增高,易发生索拉非尼耐药的患者,需要提早采取其他干预措施以改善其预后。第二部分Notch1信号通路异常激活诱导EMT导致肝细胞癌索拉非尼耐药目的:探讨Notch1信号通路、EMT在HCC索拉非尼耐药发生过程中的作用及内在联系。方法:用索拉非尼处理亲代HepG2/Huh7细胞株,索拉非尼耐药的HepG2-SR/Huh7-SR细胞株以及Notch1信号通路被抑制的HepG2-SR/Huh7-SR细胞株。克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞增殖、转移及侵袭能力。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。RT-PCR、Western blotting及免疫荧光检测Notch1信号通路相关指标Notch1、Jagged1、Hes1及EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin、VimeMicrobiology抑制剂ntin的m RNA及蛋白的表达水平。结果:1.与HepG2/Huh7细胞株相比,索拉非尼对HepG2-SR/Huh7-SR细胞株增殖、侵袭、转移的抑制能力和促凋亡能力明显减弱。2.EMT相关指标检测显示,HepG2-SR/Huh7-SR细胞株中N-cadherin和Vimentin的水平较HepG2/Huh7细胞株明显升高,而E-cadherin的水平显著降低,耐药HCC细胞株表现出增强的EMT表型。3.Notch1信号通路相关指标检测显示,与HepG2/Huh7细胞株相比,HepG2-SR/Huh7-SR细胞株中Notch1、Jagged1和Hes1的表达水平显著升高,Notch1信号通路在索拉非尼耐药HCC细胞中被激活。4.应用Notch1通路抑制剂阻断Notch1信号通路后,索拉非尼对HepG2-SR/Huh7-SR细胞株增殖、侵袭、转移的抑制能力及促凋亡作用显著增强。而且阻断Notch1信号通路成功逆转了耐药细胞的EMT表型,HepG2-SR/Huh7-SR细胞株中N-cadherin和Vimentin的水平下降,而E-cadherin的水平升高。小结:Notch1信号通路异常激活诱导EMT是肝细胞癌发生索拉非尼耐药的一个关键因素。抑制Notch1信号通路可以逆转EMT,增强索拉非尼耐药HCC细胞对索拉非尼治疗的敏感性。Notch1信号通路介导的索拉非尼耐药机制,有可能为HCC的治疗提供新的靶点。第三部分苦参碱通过抑制Notch1信号通路逆转EMT改善肝细胞癌索拉非尼耐药目的:探讨苦参碱能否增加索拉非尼耐药HCC细胞对索拉非尼治疗的敏感性及其作用机制。方法:用索拉非尼/苦参碱单药、苦参碱联合索拉非尼、苦参碱联合索拉非尼联合Notch1通路激活剂分别处理HepG2-SR/Huh7-SR细胞株。克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测不同治疗组细胞的增殖及侵袭转移能力。流式细胞术检测不同治疗组细胞周期和凋亡。RT-PCR、Western blotting及免疫荧光进一步检测索拉非尼单药组和联合治疗组Notch1信号通路相关指标Notch1、Jagged1、Hes1及EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的m RNA及蛋白的表达水平。结果:1.与索拉非尼单药组相比,联合治疗组对HepG2-SR/Huh7-SR细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用更强,促凋亡的作用也更明显。苦参碱与索拉非尼发挥协同抗肿瘤作用。2.EMT相关指标检测显示,与索拉非尼单药组相比,联合治疗组HepG2-SR/Huh7-SR细胞的N-cadherin和Vimentin水平明显降低,E-cadherin的水平显著增高,苦参碱联合索拉非尼逆转了索拉非尼耐药HCC细胞的EMT表型。3.Notch1信号通路相关指标检测显示,与索拉非尼单药组相比,联合治疗组HepG2-SR/Huh7-SR细胞的Notch1、Jagged1和Hes1的表达水平明显减低。苦参碱抑制了索拉非尼耐药HCC细胞内的Notch1信号通路。4.应用Notch1通路激活剂激活Notch1信号通路后,减弱了联合治疗对HepG2-SR/Huh7-SR细胞增殖、侵袭、转移的抑制作用及促凋亡作用,减弱了联合治疗对耐药HCC细胞EMT表型的逆转能力,协同抗肿瘤作用被削弱。小结:苦参碱与索拉非尼联合应用,能够有效增强耐药HCC细胞对索拉非尼治疗的敏感性,其机制与抑制Notch1信号通路,逆转耐药细胞EMT表型相关。第四部分苦参碱在肝细胞癌动物模型中通过抑制Notch1信号通路逆转EMT改善索拉非尼耐药目的:在体内探讨Notch1信号通路对EMT和索拉非尼耐药的影响,苦参碱对Notch1信号通路的作用,以及苦参碱与索拉非尼联合作用是否会获得与细胞水平相类似的协同抗肿瘤效应。方法:建立亲代株(HepG2)和耐药株(HepG2-SR)的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。监测不同细胞株组(HepG2,HepG2-SR)、不同药物处理组(索拉非尼单药组,索拉非尼联合苦参碱组)的肿瘤体积及肿瘤重量,评估体内肿瘤增殖情况及不同治疗组抗肝细胞癌疗效。动态监测不同治疗组荷瘤小鼠的体重及肝功能变化评估其对药物的耐受性。HE染色分析组织病理学差异。免疫组化检测肿瘤组织中EMT相关指标E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达情况。Western blotting及RT-PCR法检测Notch1信号通路相关指标Notch1、Jagged1、Hes1的蛋白及m RNA的表达水平。结果:1.在相同浓度的索拉非尼作用下,HepG2-SR组荷瘤小鼠肿瘤体积及重量明显高于HepG2组。HE染色显示HepG2-SR组的肿瘤组织坏死面积明显少于HepG2组。HepG2-SR组的间充质表型标志物(N-cadherin和Vimentin)的表达水平明显升高,上皮表型标志物(E-cadherin)的表达水平显著降低。HepG2-SR组Notch1信号通路标记物Notch1、Jagged1、Hes1的表达水平也明显升高。2.在HepG2-SR组荷瘤小鼠中,联合治疗组的肿瘤体积及重量明显低于索拉非尼单药组,HE染色显示联合治疗组的肿瘤组织坏死面积更大。与索拉非尼单药组相比,联合治疗组的间充质表型标志物(N-cadherin和Vimentin)表达水平降低,上皮表型标志物(E-cadherin)表达水平显著增高。而且,联合治疗组中Notch1、Jagged1、Hes1的m RNA和蛋白表达水平较索拉非尼单药组明显减低。3.在治疗期间没有观察到小鼠体重的显著降低,而且联合治疗对索拉非尼引起的肝损伤具有缓解作用。荷瘤小鼠对联合治疗具有良好的耐受性。小结:本部分研究在体内进一步证实,Notch1信号通路异常激活诱导EMT是导致索拉非尼耐药产生的关键因素。苦参碱可以通过抑制Notch1信号通路逆转耐药细胞EMT表型改善索拉非尼耐药,且安全性良好,能起到增效减毒的作用。结论:SIRI是预测HCC患者索拉非尼耐药及生存预后的有效生物标志物,为接受以索拉非尼为基础治疗的HCC患者提供了令人满意的风险评估。Notch1信号通路异常激活诱导EMT是肝细胞癌发生索拉非尼耐药的一个关键因素。苦参碱与索拉非尼联合应用,能够通过抑制Notch1信号通路,逆转耐药细胞EMT表型,改善索拉非尼耐药性,缓解索拉非尼引起的肝损伤,安全性良好。