产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致新生仔猪腹泻的重要病因之一,它可以通过黏附素在小肠上皮定植,产生大量的肠毒素引发宿主的腹泻。目前临床使用的抗生素因易导致细CL13900菌耐药和抗生素残留等问题限制了其应用范围,因此寻找替代抗生素的药物成为关键。将药物靶向细菌毒力因子而非细菌存活是当前控制耐药菌感染的有效策略之一,在拮抗或通过调节毒力因子的同时不杀菌从而减轻细菌的生存压力,可以防止细菌耐药性的发展。中药及其有效成分具有副作用小、无残留和不易产生耐药性等优势,在防治仔猪腹泻方面的研究越来越多。红茶中的茶黄素-3′-没食子酸酯(Theaflavin-3′-gallate,TF2B)具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多种生物活性,对多种细菌具有抗菌活性,团队前期以大肠杆菌的热敏肠毒素LTB为靶蛋白,采用分子对接的方法虚拟筛选了LT毒素的抑制剂,发现TF2B为效果较好的潜在毒素抑制剂之一,目前关于TF2B治疗ETEC引起的仔猪腹泻的效果及其作用机制报道较少。多黏菌素B(Polymyxin B,PMB)是一种兽医临床上用于治疗仔猪黄白痢的主要药物之一,能够破坏革兰氏阴性菌外膜磷脂完整性起到杀菌作用。本研究拟通过体外培养猪肠道上皮细胞(IPEC-J2),构建ETEC感染IPEC-J2细胞模型,探讨TF2B单用及其与PMB联用对ETEC感染IPEC-J2细胞的拮抗效果及其作用机制,目的是获得替代抗生素添加剂的药物以发现防治耐药菌感染的新策略。具体内容如下:在测得药物对IPEC-J2细胞的安全浓度范围以及ETEC对IPEC-J2细胞的最佳感染浓度和最佳作用时间的基础上,采用分组对比试验,以TF2B为受试药物,肠毒素抑制剂甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)和PMB为对照药物,首先确定受试药物拮抗ETEC感染IPEC-J2细胞的有效浓度;然后设置三种给药模式(即先加药后加菌、同时加药和菌、先加菌后加药),通过乳酸脱氢酶活性检测、结晶紫染色、细菌黏附率测定、LT毒素和c AMP释放测定、实时荧光定量PCR、免疫印迹和ELISA等方法,比较分析不同处理对ETEC感染细胞的毒性、ETEC致病过程、细胞炎症、细胞屏障等相关指标的影响,综合评价TF2B对ETEC感染IPEC-J2细胞的拮抗效果;此外采用微量肉汤稀释法测定TF2B对ETEC的MIC值确定其体外抗菌活性。最后通过外膜通透性实验、生物被膜检测、实时荧光定量PCR和分子对接等方法分析不同处理组细菌外膜通透性、生物被膜及毒力相关基因表达量的变化以及TF2B与LTB的虚拟结合能力,初步探索TF2B抗ETEC的作用机制。试验研究结果如下:通过构建的ETEC感染IPEC-J2细胞模型,发现TF2B通过拮抗ETEC感染造成的IPECJ2细胞毒性、抑制ETEC对IPEC-J2细胞的黏附过程和细胞的炎症反应,修复ETEC感染损伤的细胞屏障等对抗ETEC对IPEC-J2细胞的损伤,其拮抗作用是多途径的综合作用。CCK-8试验结果表明,TF2B、GL、PMB对IPEC-J2细胞的最大安全浓度分别为100μM(71.66μg/m L)、100μM(82.29μg/m L)、>100μg/m L。细胞毒性检测、黏附率检测和结晶紫染色的结果发现,当细菌与细胞数量比值(MOI)为50,感染时间为2 h时,ETEC对IPEC-J2细胞具有较高的细胞毒性和黏附率,确定其为后续试验ETEC感染IPEC-J2细胞模型的最佳感染条件。根据各受试药物对ETEC感染IPEC-J2细胞的有效浓度测定结果,确定20μM(14.332μg/m L)TF2B、20μM(16.4586μg/m L)GL、2μg/m L PMB为其后续抗ETEC感染的试验用剂量。不同处理组细胞毒性、ETEC致病过程、细胞炎症、细胞屏障等相关指标的检测结果显示,与空白对照组相比,ETEC感染组IPEC-J2细胞的死亡率、细菌黏附率和c AMP含量极显著增加(P<0.01),炎症相关因子的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,紧密连接蛋白的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下调;与ETEC感染组相比,先加药后加菌以及同时加药和细菌方式ETEC+TF2B组细菌的黏附率极显著降低(P<0.01),先加菌后加药方式ETEC+TF2B组细菌的黏附率无显著变化(P>0.05),ETEC+TF2B组的三种给药方式IPEC-J2细胞的死亡率和细胞c AMP的含量极显著降低(P<0.01),细胞的损伤得到了明显的改善,炎症相关因子IL-6、IL-1β以及TNF-α的m RNA和蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01),紧密连接蛋白ZO-1、Occludin以及Claudin-1的m RNA和蛋白的表达水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。与ETEC+TF2B组和ETEC+PMB组相比,先加药后加菌方式ETEC+TF2B+PMB组IL-6 m RNA和蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01),ZO-1 m RNA和蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01),结果表明,TF2B与PMB联用在缓解ETEC对细胞的炎症反应和修复细胞屏障损伤方面具有协同作用。MIC测定结果表明TF2B对ETEC不具有显著的抗菌活性。由细菌外膜通透性实验、生物被膜检测实验和毒力基因表达测定结果可知,与对照组相比,TF2B极显著抑制了ETEC生物被膜的形成(P<0.01),极显著下调了bss S基因和immunobiological supervisionfae G基因的表达(P<0.01),但TF2B组细菌外膜的通透性以及其它毒力基因的表达与对照组相比无显著差异(P?0.05),TF2B+PMB组elt A基因的表达水平极显著低于TF2B组和PMB组(P<0.01),bss S基因的表达水平显著低于TF2B组(P<0.05),极显著低于PMB组(P<0.01)。上述结果表明TF2B能够抑制ETEC生物被膜的形成,抑制bss S基因和菌毛亚基的表达是TF2B抗ETEC感染的主要机制。TF2B与PMB联用对抑制生物被膜相关基因bss S和LT毒素A亚基的表达具有协同作用。虚拟分子对接结果表明,TF2B可以与LTB的活性位点结合,且与结合位点的氨基酸残基形成氢键、范德华力等相互作用,使TF2B与LTB结合的构象更稳定,说明TF2B与LTB蛋白结合可能是其发挥抗ETEC感染的作用机制之一。综上所述,TF2B通过降低ETEC对IPEC-J2细胞的毒性、细菌黏附率、细胞c AMP水平,抑制ETEC感染引起的细胞炎症及修复ETEC感染引起的细胞屏障损伤等途径达到体外抗ETEC感染作用,TF2B对ETEC不具有显著的抗菌活性,而抑制ETEC生物被膜的形成以及生物被膜相关基因bss S和菌毛亚基的表达,直接与LTB毒素蛋白结合等是TF2B体外抗ETEC感染的主要作用机制。本研究结果为进一步评价TF2B的体内药效及研制有效防治https://www.selleck.cn/products/gsk1120212-jtp-74057.htmlETEC引起的仔猪腹泻的有效药物提供理论依据。