酿酒酵母作为一种研究广泛的单细胞真核模式生物,其生理以及遗传背景清晰,是优良的碳代谢研究模型。酿酒酵母代谢特征独特:在批次培养过程中,当葡萄糖充足,无论通氧情况如何,酿酒酵母首先利用葡萄糖进行强酵解代谢,TCA循环和呼吸链均被抑制,造成代谢溢流,积累大量乙醇。当葡萄糖耗尽,酵母通过级联的信号途径做出响应精确调控代谢网络转变为呼吸代谢模式,利用前期积累的乙醇进行二次生长。这种特殊代谢模式引起科学家的长期关注,目前大量工作在转录和蛋白磷酸化修饰等水平对其进行了解释。赖氨酸乙酰化是真核生物和细菌中普遍存在的蛋白质翻译后修饰(PTM),在许多细胞生理和病理过程中起着重要的作用。乙酰化最初是在组蛋白中被发现,它主要通过改变染色质结构进而对基因转录进行调控。而随着质谱技术的发展,越来越多的非组蛋白MLN4924 IC50乙酰化位点被鉴定出来,例如在酵母中发现大量代谢酶被乙酰化,这也说明乙酰化修饰在细胞中广泛存在。然而,关于蛋白乙酰化修饰是否参与二次生长的研究还相对较少,本文探讨了蛋白乙酰化修饰参与酿酒酵母二次生长的调控机制,具体研究内容如下:1、本研究第一部分工作是明确酿酒酵母中非组蛋白乙酰化是否参与二次生长调节。首先利用高分辨质谱探查了酿酒酵母在批次发酵过程葡萄糖耗尽前后,即酵母利用发酵性碳源葡萄糖生长时和利用前期积累的非发酵性碳源乙醇进行二次生长时,蛋白乙酰化组的差异。组学结果显示,在两种碳源条件下,大量的非组蛋白乙酰化状态存在差异,表明蛋白乙酰化修饰涉及酿酒酵母的多个代谢通路。之后对碳代谢途径代谢蛋白在酵解代谢以及呼吸代谢阶段的乙酰化差异分析表明乙酰化修饰在碳源切换时是动态的,并且这种动态修饰广泛存在。之后,我们选择了两种碳源条件下乙酰化状态有明显差异的部分中心碳代谢途径蛋白,研究其发生乙酰化、脱乙酰化修饰时对酿酒酵母生理代谢的影响。在我们研究的10个酶蛋白的14个乙酰化位点中,Acs2、Ald6、Pck1、Pdc1等代谢酶的乙酰化、脱乙酰化模拟突变体呈现影响酵母细胞生长及生理代谢的特征。其中,Ald6的K474位乙酰化修饰参与酿酒酵母二次生长的调节,首先,Ald6的K474在葡萄糖酵解代谢阶段处于去乙酰化状态,乙醛脱氢酶活性高,部分乙醛转化为乙酸,这一过程可以生成NADPH,为细胞快速生长时所需生物大分子的合成Adverse event following immunization提供还原力;其次,进入乙醇呼吸代谢阶段后,Ald6的K474位处于乙酰化修饰状态,酶活性降低,NADPH生成减少,和该阶段细胞生长减慢,所需NADPH减少的需求相匹配。因此,乙酰化修饰可以作为一种适应性策略来参与酿酒酵母二次生长的调节。此外,当表达Ald6的K474Q突变子以模拟组成型乙酰化时,能够显著降低菌株的乙酸积累,提高甘油、乙醇产量,这种表型在工业生产中有一定的应用价值。2、本工作第二部分主要研究Ald6的乙酰化影响酶活的结构基础,并尝试寻找催化Ald6乙酰化和去乙酰化的乙酰转移酶(KATs)以及脱乙酰化酶(KDACs)。Ald6同源蛋白的结构分析和突变模拟结构显示,AAZD2281体内实验剂量ld6的K474位不处于酶活性中心,不是NADP的结合位点,但是对于正确形成乙醛脱氢酶的同源四聚体比较重要。因此,我们推测,当K474位被乙酰化时,四聚体形成的结构不完全正确,降低了酶活性从而影响代谢。这是本工作首次揭示的乙酰化修饰参与二次生长调节的一个范例。之后,我们初步探查了酿酒酵母乙醛脱氢酶Ald6的KATs和KDACs,发现目前已知的KATs和Ald6都有相互作用,虽然我们尚未鉴定出具体催化Ald6乙酰化的KATs,但考虑到Ald6上有多个乙酰化位点,其乙酰化修饰有极大的可能由多个KATs催化。在KDACs方面,Ald6的K414位去乙酰化修饰主要由HDACs家族的脱乙酰化酶催化,而K474位的去乙酰化,则是HDACs和Sirtuins家族的脱乙酰化酶都有参与。