研究背景:心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是全球范围内的慢性疾病,严重威胁着人类的健康。当前,由于我国心血管疾病的发病率、病死率逐年上升,心血管疾病治疗成本和医疗负担日益加重,是我国当前必须面临的重大公共卫生问题,亟待采取相应措施防治心血管病。急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)是心血管疾病中最为危急的一种。早期干预,迅速开通闭塞血管,挽救濒临坏死心肌,对于改善AMI预后意义重大。在急性心肌梗死的临床管理中,患者的危险分层与预后评估是至关重要的一环,准确的风险评估对于尽早识别高危患者,指导合理的诊疗决策,告知患者病情和改善预后等方面有重要作用。在临床研究中,乳酸水平被认为是评估炎症性疾病严重程度和评估治疗反应的生物标志物。值得注意的是,乳酸水平并非静态恒定,而是随病情波动而变化的。这一特性促使研究者提出假设:动态监测乳酸变化趋势或能进一步提升诊断的精确度,并据此提出乳酸清除率可作为实时指导临床策略制定的有力工具。近年来,心肌组织能量代谢重构在心脏发病中的重要作用逐渐凸显。研究表明心梗后心肌组织因缺氧发生能量代谢重塑,心肌组织产生大量乳酸堆积,然而其具体作用存在争议,且深层机制尚不明确。当发生急性心肌梗死时,由于心肌细胞缺血缺氧,能量供给从主要依赖脂肪酸氧化转变为葡萄糖无氧糖酵解,在此过程中细胞内乳酸堆积,刺激单羧酸转运蛋白4(Monocarboxylate Transporter 4,MCT4)表达量升高以转运乳酸出细胞。我们新近发现乳酸升高可能是心梗后急性期机体进行内源性调节保护的重要表现,特异性敲除心肌细胞表面乳酸转运蛋白MCT4,可以抑制乳酸外排来改善急性期心脏功能障碍。基于预实验结果我们首次提出乳酸可能独立于代谢之外,以组蛋白乳酸化修饰方式调控线粒体复合体稳态相关基因的表达,从而改善线粒体功能。本课题组拟在前期研究基础上,揭示乳酸介导的表观遗传修饰在线粒体功能稳态中的关键作用,并进一步揭示其在心梗后主要心血管不良事件发病中的调节机制。综上所述,本研究旨在通过研究动脉血乳酸清除率与ST段抬高型急性心肌梗死患者预后的关系,构建ST段抬高型急性心肌梗死患者的预后模型,利用乳酸清除率为患者的临床策略提供指导。同时,本课题计划通过动物实验,探究乳酸及乳酸化修饰在急性心肌梗死过程中的保护作用及机制,为认识乳酸及乳酸盐在临床方向应用于急性心梗患者提供新见解和参考。研究目的:1.探究动脉血乳酸水平及清除率与ST段抬高型急性心肌梗死患者预后的关系,建立ST段抬高型急性心肌梗死患者的预后模型,为临床利用乳酸清除率为患者的临床策略提供指导。2.以心梗小鼠为动物模型开展基础研究,揭示乳酸及乳酸调节蛋白在心梗后心肌损伤修复中的关键作用及机制。研究方法:第一部分:乳酸水平及乳酸清除率与心梗后主要心血管不良事件的研究选取2022年1月至2023年3月在空军军医大学第二附属医院心内科住院确诊为ST段抬高型急性心肌梗死(STEMI)并行急诊经皮冠脉介入(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)手术治疗后的患者。测定入院首次和24 h的动脉血乳酸水平并计算清除率。通过电话或门诊随访患者出院后90天内是否发生主要心血管不良事件。根据患者随访结果对每例患者予以分组,发生主要心血管不良事件的患者共31例,未发生主要心血管不良事件的患者共160例,比较两组患者的基线资料。第二部分:乳酸及调节蛋白对心梗后心脏结构和功能的影响及作用机制构建小鼠心梗模型(手术结扎冠脉左前降支),进行转录组测序,分析心梗前后差异基因,利用Western blot和RT-PCR探究MCT4蛋白在不同时间点的表达情况。同时检测乳酸在心肌组织和血清的变化情况。为进一步探究MCT4心肌敲低对心梗后心功能的影响,构建含有心肌特异性启动子的AAV9-MCT4病毒载体,在AAV9注射3周后构建心梗模型,并在术后1天、7天和14天检测心功能。同时在心梗术后14天,Masson染色和qPCR分别检测心梗后主要心血管不良事件标志物和纤维化标志物水平。在术后1天检测心肌组织和血清乳酸水平。为探究MCT4心肌敲低对心梗后保护作用的分子机制,对MCT4敲低小鼠及其对照小鼠构建心梗模型后,取梗死区心肌组织进行转录组测序。每组3只小鼠,对测序结果进行生物信息学分析。首先筛选出差异基因,分别进行热图、火山图分析。然后对差异基因进行富集分析以探究潜在的信www.selleck.cn/products/Docetaxel(Taxotere)号通路,包括GO富集分析、KEGG通路分析和Reactome通路分析。Western blot检测组蛋白乳酸化水平和组蛋白位点乳酸化水平,并进行心梗组织的组蛋白H3K18乳酸化CUT-TAG测序,对测序结果进行生物信息学分析,筛选出组蛋白H3K18乳酸化发挥心梗后保护作用的下游基因,并对机制进行进一步探究。研究结果:第一部分:乳酸水平及乳酸清除率与心梗后主要心血管不良事件的研究对191名心梗患者出院后进行随访,随访3个月,共有31名患者发生心梗后主要心血管不良购买Puromycin事件,其中在舒张压、吸烟史、肾小球滤过率、D-二聚体、总胆固醇、pro-BNP、中性粒细胞绝对值、植入支架个数、肌钙蛋白、入院首次乳酸、24h乳酸清除率具有统计学意义(P<0.01或P<0.05,),而性别、糖尿病史、高血压病史等差异无统计学意义(P>0.05)。以心梗后主要心血管不良事件发生为结局变量,进行危险因素的单因素回归分析,发现总胆固醇、肾小球滤过率、pro-BNP、入院首次乳酸、入院首次PH、入院24h乳酸、24h乳酸清除率、吸烟史在两组之间有差异,并对这些自变量进行多因素Cox回归分析,结果显示只有总胆固醇、肾小球滤过率、24h乳酸清除率有显著意义。利用SPSS软件绘制心梗患者危险因素总胆固醇(P<0.05)、肾小球滤过率(P<0.05)、24h乳酸清除率(P<0.05)出院后3个月内发生主要心血管不良事件ROC曲线。结果提示24h乳酸清除率(LC)的AUC值为0.823。第二部分:乳酸及调节蛋白对心梗后心脏结构和功能的影响及作用机制转录组测序结果提示在心梗后小鼠心肌组织MCT4表达显著升高,qPCR和Western blot也证实心梗后MCT4在m RNA水平和蛋白水平呈现先升高后降低的趋势,在心梗后1天和3天升高最显著。乳酸水平在心梗后显著升高。在使用AAV9病毒敲低MCT4后进行心梗造模,TTC染色显示,与对照组相比,MCT4心肌敲低组心梗后1天心肌梗死区显著减小。超声心动图结果显示,心梗后对照组小鼠心功能显著下降,而MCT4心肌敲低组显著改善心功能。Masson染色和qPCR显示MCT4心肌敲低有效减少了小鼠心肌梗死面积,降低了心梗引起的心衰和纤维化标志物水平。乳酸测量表明MCT4心肌敲低组乳酸水平显著高于心梗对照组。在腹腔注射乳酸5天后,进行心梗造模,发现注射乳酸和MCT4心肌敲低有相似的心梗改善结果。对心梗后的MCT4心肌敲低小鼠和对照小鼠进行了心肌转录组测序。KEGG分析以及GO富集分析表明发生变化的基因主要集中在氧化磷酸化,线粒体电子传递链以及ATP产Spine infection生等方面。Western blot发现蛋白泛乳酸化水平和组蛋白H3K18位点乳酸化水平显著升高,为了探究组蛋白乳酸化在MCT4心肌敲低组和腹腔注射乳酸组在心梗后发挥保护作用的分子机制,对MCT4心肌敲低组和对照组进行H3K18Lac的CUT-TAG测序,发现1138个基因的启动子区域发生H3K18的乳酸化修饰。对这些基因和转录组测序发生改变的基因进行联合分析,最终选择PGAM1、PRKAA2、PFKM、IRE3、ENO1等一簇糖酵解代谢相关基因作为H3K18乳酸化修饰发挥心梗后保护作用可能影响的下游基因。研究结论:1.ST段抬高型急性心肌梗死患者入院后全身动脉血乳酸清除速率与出院后发生主要心血管不良事件密切相关,为心梗患者提供潜在的预后评价指标。2.乳酸转运蛋白MCT4在小鼠心梗后显著升高,并伴有心肌组织和血清乳酸水平的升高。3.通过心肌敲低MCT4增加细胞内乳酸显著改善小鼠心梗后心功能和梗死面积。4.心肌敲低MCT4通过增加组蛋白乳酸化和组蛋白H3K18位点乳酸化修饰水平改善心梗后心功能障碍。5.组蛋白H3K18位点乳酸化通过增加PGAM1、PRKAA2、PFKM、IRE3、ENO1等糖酵解代谢相关基因改善心梗后的心功能障碍。