研究背景和目的变应性接触性皮炎是皮肤科临床中最常见的接触性超敏反应之获悉更多一,其典型的组织病理学特征为表皮坏死、细胞间海绵水肿、真皮小血管扩张和浅层炎症细胞浸润等。既往研究认为,皮肤暴露于半抗原导致的抗原递呈细胞激活、T淋巴细胞的活化及其介导的炎症因子释放,均在接触性超敏反应中发挥重要作用,角质形成细胞在超敏反应中被认为是炎症终末阶段的“靶细胞”。然而近年研究发现,角质形成细胞可以主动地参与到皮肤炎症反应中,发挥“效应器”的作用。而在皮肤接触性超敏反应中,角质形成细胞是否主动参与了炎症反应的调节,目前尚未清晰阐明。因此,本研究旨在探索角质形成细胞在接触性超敏反应炎症中的作用,以及通过何种机制参与其炎症调控,并期望基于此探索潜在的治疗策略。实验方法1.通过将DNCB外涂于小鼠耳部皮肤,构建接触性超敏反应小鼠模型,并通过皮炎评分、鼠耳厚度测量、鼠耳称重、免疫组化染色等方法评估该模型2.通过鼠耳组织TUNEL染色评估鼠耳表皮角质形成细胞的总体死亡水平。3.通过免疫印迹法检测鼠耳皮肤组织中程序性坏死关键分子RIPK1、RIPK3及MLKL的磷酸化水平,并通过免疫荧光染色进一步检测角质形成细胞胞内MLKL的磷酸化水平。4.繁育角质形成细胞Mlkl条件性敲除小鼠,探索阻断角质形成细胞内MLKL介导的程序性坏死对接触性超敏反应炎症产生的影响,并通过免疫组织化学染色CD4、CD8、MPO等评价多种炎症细胞的浸润水平。5.分别通过腹腔注射RIPK1抑制剂或外用MLKL抑制剂治疗DNCB诱导的小鼠接触性超敏炎症,评价靶向角质形成细胞程序性坏死的效果。6.探究临床上常用于治疗接触性皮炎的药物0.075%地塞米松乳膏是否也能够抑制程序性坏死通路。7.在体外培养的人角质形成细胞细胞系HaCaT细胞中,利用TNF-α和IFN-γ模拟接触性超敏反应的炎症微环境,进一步探索地塞米松对角质形成细胞程序性坏死的影响。通过台盼蓝染色、PI染色评价细胞死亡水平,并通过免疫印迹法检测程序性坏死通路关键分子RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平。8.通过转染慢病毒的方法构建MLKL敲低的HaCaT细胞,在TNF-α和IFN-γ处理后分别提取胞质内、胞核内及释放到培养上清中的蛋白,并检测其中高迁移率相关族蛋白B1(HMGB1)的水平。9.在Mlkl角质形成细胞条件性敲除小鼠的鼠耳中皮内注射重组HMGB1蛋白,观察其是否能够使DNCB诱导的接触性超敏炎症反应重新出现。研究结果1.将1%浓度的DNCB外涂于小鼠耳部皮肤进行初步致敏、1周后同位置涂抹0.5%浓度的DNCB进行激发,成功构建接触性超敏反应小鼠模型,外观上出现红斑、水肿、糜烂等表现,鼠耳immediate memory厚度及单位重量均明显增加,通过H&E染色可以明显观察到鼠耳组织出现表皮坏死、细胞间水肿及真皮浅层大量炎症细胞浸润。2.接触性超敏反应小鼠模型中鼠耳皮肤组织内程序性坏死关键分子RIPK1、RIPK3及MLKL的磷酸化水平明显升高,程序性坏死通路被激活,并通过TUNEL染色证实表皮内角质形成细胞总体死亡水平升高。3.角质形成细胞Mlkl条件性敲除小鼠耳部皮肤对DNCB诱发的接触性超敏炎症响应能力显著降低,表现为炎症表型减轻、表皮角质形成细胞死亡水平降低。真皮中CD4+和CD8+的T淋巴细胞浸润水平与对照组无差别,但中性粒细胞活化标记(MPO、MMP-9和NE)水平明显降低。4.腹腔注射RIPK1抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)、外用MLKL特异性抑制剂TC13172均可通过抑制角质形成细胞程序性坏死,进而缓解DNCB诱导的小鼠接触性超敏反应炎症。5.0.075%地塞米松乳膏在缓解小Z-VAD-FMK鼠接触性超敏反应皮肤炎症的同时抑制了程序性坏死通路。6.在TNF-α和IFN-γ诱导的接触性超敏反应体外HaCaT细胞模型中,地塞米松可以降低RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平,抑制程序性坏死,并减少细胞死亡。7.HaCaT细胞在TNF-α和IFN-γ刺激后,胞浆内的HMGB1降低,培养上清中的HMGB1升高,表明HMGB1向胞外的分泌增加。而在MLKL敲低的HaCaT细胞中,胞浆内及上清中释放的HMGB1水平均明显减低。8.予角质形成细胞Mlkl条件性敲除的小鼠鼠耳皮内注射HMGB1重组蛋白,能够复现DNCB诱导的接触性超敏炎症反应。结论在接触性超敏反应的炎症环境中,角质形成细胞中程序性坏死通路被激活,MLKL介导的促炎因子HMGB1的释放增加,放大了接触性超敏反应的炎症信号,并进一步加剧皮肤组织损伤。通过三种不同方式抑制小鼠角质形成细胞中程序性坏死通路的激活后,均能够缓解皮肤接触性超敏反应炎症、减轻组织损伤。此外,临床治疗接触性皮炎的经典外用药地塞米松也可通过抑制角质形成细胞程序性坏死这一新的机制参与调节接触性超敏反应炎症。