铜作为植物的必需营养元素之一,对植物生长、花器官发育、产量与品质均十分重要。水稻是我国最重要的粮食作物之一,而我国水稻主产区约有20%以上的土壤缺铜。近年来,高强度集约化土地利用方式以及复种比例的增加,加大了土壤养分的携出量,破坏了土壤养分平衡、加速了土壤退化进程,易造成耕地潜在的铜缺乏问题。缺铜易导致水稻生长缓慢、抽穗推迟、花粉活性降低、结实率低等现象,因此挖掘水稻响应缺铜的相关基因,解析其生物学功能和分子调控机制,以提高水稻对铜的吸收和利用效率对水稻产量形成具有重要意义。然而,目前缺铜胁迫下水稻中调控铜吸收、转运和分配过程的分子机制仍不清楚。课题组前期通过对不同铜浓度处理下的水稻植株进行转录组分析,获得一个受缺铜诱导表达功能未知的WRKY转录因子OsWRKY37。本研究系统分析了OsWRKY37在水稻不同生育期、不同组织器官中的表达模式,通过创建超量表达株系和敲除突变体研究了OsWRKY37在水稻铜吸收、转运和分配过程中的功能及其对植株生长、花粉发育和产量形成的影响;进一步通过转录组测序、酵母单杂交、烟草叶片瞬时表达、EMSA和原位RT-PCR等试验明确OsWRKY37的下游调控基因,构建其在铜吸收和转运中的分子调控模块此网站,研究结果以期为进一步培育铜营养高效、高产优质水稻品种提供理论基础及基因资源。主要研究结果如下:(1)OsWRKY37受缺铜诱导,在水稻AMG510体内根、维管束组织、花药中大量表达。OsWRKY37属于WRKY转录因子家族,含有4个外显子。亚细胞定位结果表明,OsWRKY37定位于细胞核。转录激活实验证明OsWRKY37能够行使转录功能。荧光定量PCR分析结果显示,营养生长时期OsWRKY37在水稻根系中表达水平较高,生殖生长时期则在根系、基部节、老叶节和幼穗中表达较强。利用Pr OsWRKY37:GUS转基因系,通过GUS染色发现,OsWRKY37在根、叶片、叶枕、节的维管组织、新生小穗以及花药中高度表达。同时,短期缺铜可诱导OsWRKY37在水稻幼苗根和基部节中的表达,而恢复供铜可抑制其表达水平,但是外界铜Rescue medication水平对幼苗地上部的表达水平影响不大。(2)缺铜胁迫下,OsWRKY37促进水稻铜的吸收转运和分配。在营养生长时期,与野生型相比,OsWRKY37超量表达株系和敲除突变体的生长表型没有显著变化,但是缺铜条件下OsWRKY37的超量表达显著增加了各部位中的铜含量,提高了根系对铜的吸收能力以及木质部汁液中的铜含量,而敲除突变体中铜从根向地上部的转运系数和木质部汁液中的铜含量均显著降低。在生殖生长时期,缺铜条件下敲除突变体表现出植株发育迟缓、晚抽穗、晚开花、产量下降的表型。敲除OsWRKY37减少了铜从根向地上部的运输以及从源(叶)到库(籽粒)的分配,破坏了花药中铜的积累,导致花粉表皮角质缺陷、活力降低、体外萌发受损、育性降低,该表型可通过在水稻顶端喷施Cu SO4溶液得到恢复。(3)OsWRKY37正调控OsCOPT6和OsYSL16的表达水平。通过OsWRKY37敲除系与野生型的RNA-Seq分析,发现OsWRKY37敲除突变体中11个铜运输相关基因的表达水平发生显著变化。进一步通过酵母单杂交、烟草瞬时表达、EMSA试验证实OsWRKY37能够与铜转运蛋白OsCOPT6和OsYSL16的启动子相互结合。荧光定量PCR和原位RT-PCR的结果表明,OsWRKY37可以正向调控OsCOPT6和OsYSL16的表达水平。(4)OsCOPT6促进水稻缺铜响应中铜的吸收。亚细胞定位结果表明,OsCOPT6定位于细胞膜。对OsCOPT6敲除突变体进行分析,结果表明,缺铜条件下敲除OsCOPT6后降低了水稻的生物量、铜含量、铜积累量以及根系对铜的吸收能力,同时该突变体也表现出晚开花的现象。综上所述,缺铜可诱导OsWRKY37的转录,OsWRKY37可与OsCOPT6和OsYSL16的启动子相互结合,正向调控其表达水平,促进水稻植株对铜的吸收以及向地上部及生殖器官中的转运,有利于水稻花器官的正常发育及产量形成。