非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)所引起的一种急性、致死性的猪传染病。自1921年在肯尼亚发现以来,ASFV已对世界养猪业造成了毁灭性的打击,尤其在2018年传入中国之后给中国经济带来巨大的损失。但由于现今仍无可用的商业化疫苗,针对ASF的防控极为困难,只能通过严格的生物安全措施来控制。已知pA137R是ASFV所编码的一个重要毒力因子,其缺失后可显著降低ASFV的毒力,并且该缺失毒可诱导动物体内产生高水平的抗体,为动物提供保护性免疫,因此pA137R可作为疫苗研发的bile duct biopsy候选靶标。但pA137R结构和生物学功能上的研究还存在较大空白,为探究其生物学功能及在ASFV感染过程中所发挥的作用,本研究开展了以下工作:1.pA137R蛋白生物信息学分析、表达纯化以及pA137R抗体的制备通过生物信息学预测分析pA137R的理化性质,发现pA137R是一个亲水性蛋白,但由于蛋白结构中存在较多无序loop结构,因此该蛋白稳定性可能较差。不同毒株之间的氨基酸序列比对结果表明pA137R在不同毒株之间的同源性高,约在90%-100%。在此基础上,本研究利用原核表达系统对pA137R蛋白进行了表达与纯化,获得了高纯度的蛋白,且制备了高效价的pA137R特异性抗体。2.pA137R亚细胞定位及在ASFV感染后的表达情况探究利用激光共聚焦显微镜对pA137R的亚细胞定位进行观察,发现pA137R定位于细胞内质网。Western Blot探究ASFV感染后pA137R的表达情况,结果显示pA137R蛋白表达可在感染后8 h检测到,且之后维持稳定的表达水PS-341采购平。因此pA137R蛋白可能主要集中在病毒感染的中晚期表达。3.pA137R抑制宿主IFN-Ⅰ应答的分子机制探究前期研究表明pA137R的缺失毒可诱导宿主产生保护性免疫,因此本研究探究了pA137R作为毒力因子对宿主先天性免疫的影响。双荧光素酶报告系统和荧光定量PCR实验发现pA137R可以显著抑制宿主Ⅰ型干扰素(Type确认细节 I IFN,IFN-I)的产生,且通过免疫共沉淀串联质谱发现pA137R能够与c GAS-STING通路上的重要因子TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)互作。为进一步探究pA137R抑制宿主IFN-Ⅰ应答的结构基础和分子机制,本研究通过全长、截短和融合MBP标签等多种蛋白形式及各种结晶方法获得分辨率15(?)左右的pA137R晶体,但还不足以解析pA137R蛋白结构。因此通过Alpha Fold 2模拟了pA137R的蛋白结构,发现其结构中包括5个α-helix和4个β-sheet,整体类似于发卡结构,同时存在较多的无序loop。利用模拟的pA137R结构与TBK1进行分子对接,发现pA137R的F34-E39、T43-K52、E54-E60、H62-E73、L76-R80、L89-T93和A115-K131七个区域参与互作。通过双荧光素酶报告系统和结构分析进一步探究发现pA137R可能通过H62-E73、L76-R80和L89-T93三个关键区域抑制TBK1的激酶活性,从而抑制宿主IFN-Ⅰ应答。综上,本研究对pA137R的蛋白结构和生物学功能进行了探究,发现pA137R能够抑制宿主IFN-Ⅰ的产生,并基于结构探究了其抑制作用的分子机制,为ASFV疫苗的精准设计提供了理论基础。