牛子宫内膜炎是养殖中常见的生殖疾病之一,影响发情周期,降低生殖效率等。细菌感染是常见因素,包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等,其中金黄色葡萄球菌会诱发亚临床或慢性子宫内膜炎。脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)存在于金黄色葡萄球菌细胞壁中,在诱导疾病中发挥关键作用。牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEECs)是子宫内膜抵御的首要防线,在多种刺激下发生炎症反应,影响牛的生殖性能。抗生素在临床上广泛使用,但过度使用会出现耐药性、药物代谢等问题,需要寻找新的替代药物。近年来,多项研究发现非瑟酮作为一种天然黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎等生物活性,可用于防治肺炎、乳腺炎等多种疾病。基于以上所述,本研究使用BEECs构建体外模型,使用小鼠进行在体试验,研究非瑟酮对LTA诱导的炎症和氧化应激反应。具体研究内容如下:(1)牛子宫内膜上皮细胞培养与体外炎症和氧化应激模型的建立培养牛子宫内膜上皮细胞,贴壁后形态呈“铺路石样”。免疫荧光结果显示:上皮细胞角蛋白18(CK-18)表达呈阳性,细胞系纯,为后续实验奠定基础。CCK-8检测发现,LTA浓度>25μg/m L时会显著影响细胞活力;ROS水平检测、Western blot、RT-q PCR反应进一步发现:25μg/m L的LTA诱导细胞48 h后产生大量ROS,TNF-α、IL-1β表达水平显著升高。综合表Gefitinib试剂明,采用浓度为25μg/m L的LTA诱导细胞48 h来构建体外细胞炎症和氧化应激模型。(2)非瑟酮对LTA诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症和氧化应激反应调控作用的研究首先用CCK-8法检测非瑟酮对细胞活力的影响,发现非瑟酮浓度≥100μg/m L时会显著降低细胞活力,试验共分6组(n=3),分别为对照组、LTA组、LTA+非瑟酮(12.5、25、50μg/m L)组、非瑟酮(50μg/m L)组,采用RT-q PCR、Western blot等方法对非瑟酮调控作用进行分析。发现不同浓度非瑟酮可抑制LTA诱导的TLR2的表达及下游NF-κB的活化,减少TNF-α、IL-1β的分泌,促进Nrf2及下游NQO1、SOD等的表达,减少ROS和MDA的积累,表明非瑟酮可缓解LTA诱导的牛子宫内膜上皮细胞炎症和氧化应激反应。(3)非瑟酮对LTA诱导下小鼠子宫内膜炎症和氧化损伤反应调控作用的研究使用昆明小鼠进行在体试验,采用子宫灌注法将5 mg/kg的LTA溶液注入小鼠子宫内诱导24 h,之后腹腔注射不同剂量的非瑟酮溶液(25 mg/kg和50 mg/kg)作用24 h,小鼠颈部处死,收集子宫样本。采用H(5)E染色、RT-q PCR、Western blot等方法进行样本分析。结果显示:LTA灌注后明显可见小鼠子宫肿大、缩短、内膜上皮细胞和深层结构可见较多中性粒细胞浸润;激活TLR2介导的NF-κB通路,增加MDA和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的表达。不同剂量非瑟酮处理后小鼠子宫形态逐渐恢复正常,内膜上皮细胞内中性粒细胞浸润减少;抑制NF-κB通路的活化,减少TNFAZD6738配制-α、IL-1β的产生;促进Nrf2的表达,增加NQO1、SOD等抗氧delayed antiviral immune response化酶的表达水平,减少MDA的积累。综合表明,非瑟酮可缓解LTA诱导下小鼠子宫内膜炎症和氧化损伤反应。综上所述,非瑟酮可通过抑制NF-κB信号通路的活化,减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌,增加Nrf2及下游NQO1、SOD等抗氧化酶的表达,减少ROS、MDA的积累来缓解LTA诱导子宫内膜炎症和氧化应激反应。