目的:高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1,HMGB1)作为重要的晚期炎症递质有促炎活性,会在牙龈炎症过程中迅速释放[1],感染促进牙周组织分泌HMGB1,分泌的HMGB1参与牙周炎的持续加重[2]。另一项研究报道,HMGB1从上皮细胞的细胞核脱位,定位于牙周炎患者的牙龈上皮细胞质[3]。除了促炎活性外,最近在小鼠牙周炎模型中HMGB1还被证明促进骨吸收[4]。吸烟是牙周炎的独立危险因素,会抑制免疫系统的激活,损害上皮细胞的宿主防御功能,增加宿主对牙周病原菌的易感性[5]。但吸烟对HMGB1在牙周炎中相关作用的影响并不明确,目前研究较少,且结果不一,没有做相关性分析。本实验通过研究吸烟对牙周炎患者牙龈组织的HMGB1表达水平的影响及香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)对HMGB1刺激巨噬细胞分化为破骨细胞的影响,探讨HMGB1、吸烟之间相互作用对牙周炎的炎症发展和破骨细胞表达的影响。方法:1.吸烟对牙龈组织HMGB1表达的影响1.1牙龈组织的收集:将收集的牙龈分为健康组,吸烟组,牙周炎组,伴吸烟牙周炎组。1.2 HMGB1蛋白检测:将牙龈组织制成切片,HE染色观察各组牙龈组织学差异,免疫组织化学染色法检测牙龈组织中HMGB1蛋白的分布和表达。1.3 HMGB1 m RNA检测:RT-PCR法检测各组牙龈组织HMGB1m RNA的表达2.CSE对HMGB1刺激破骨细胞分化的影响2.1小鼠骨髓来源单核巨噬细胞(Bone marrow-derived monocytes macrophages,BMMs)的培养:提取6-8周c57/BL6小鼠股骨、胫骨骨髓间充质细胞,10ng/ml M-CSF诱导其分化为BFer-1抑制剂MMs,分为空白对照组、阴性对照组(1μg/ml anti-HMGB1),阳性对照组(40ng/ml TNF-α),1%CSE组,1μg/ml r HMGB1组,1%CSE+1μg/ml r HMGB1组。2.2 TRAP染色鉴定破骨细胞:BMMs培养基中加入50ng/ml RANKL,继续诱导7-10d[6],镜下观察细胞核>3个,TRAP染色阳性的多核巨细胞为成熟破骨细胞。2.3 RT-PCR检测破骨细胞相关基因m RNA表达情况:检测CSE刺激后破骨细Torin 1生产商胞相关基因integrin 3,MMP 9,TRACP,cathepsin K和calcitonin R的表达。结果:1.HMGB1在伴吸烟牙周炎病变牙龈组织表达1.1四组牙龈的组织形态学表现不同,与健康组牙龈组织相比,吸烟组可见少量炎症细胞分布,牙周炎牙龈组织钉突下方可见有大量炎症细胞浸润,胶原纤维排列紊乱,部分纤维结构发生断裂、破坏,毛细血管增生、扩张,伴吸烟牙周炎组炎症最严重。1.2四组牙龈均有HMGB1蛋白的表达,IHC结果显示HMGB1主要分布在固有层中,健康组中的HMGB1多集中在细胞核内,吸烟组、牙周炎、牙周炎伴吸烟组中HMGB1部分分布于细胞质及细胞外,伴吸烟牙周炎组表达量显著大于其他各组(P<0.001)。1.3四组牙龈组织中均有HMGB1 m RNA的表达,且牙周炎伴吸烟组>吸烟组>健康组,牙周炎伴吸烟组>牙周炎组>健康组(P<0.05);牙周炎组>吸烟组(P>0.05)。2.BMMs原代培养所有实验组均培养出BMMs,镜下观察呈圆形,形态均一。3.破骨细胞诱导所有实验组均诱导出清晰、多核的破骨细胞,TRAP染色阳性。4.CSE对HMGB1刺激破骨细胞分化的影响4.1 HMGB1刺激破骨细胞分化4.1.1 TRAP染色计算TRAP阳性细胞占比,结果为1μg/ml r HMGB1组>空白组>anti-HMGB1组(P<0.05)4.1.2 HMGB1刺激破骨细胞相关基因的表达1μg/ml r HMGB1组>空白组>anti-HMGB1组(P<0.05)4.2 CSE促进HMGB1刺激破骨细胞分化4.2.1 TRAP染色阳性细胞占比为1%CSE+1μg/ml r HMGB1组>1μg/ml r HMGB1组>空白组(P<0.05);1%CSE+1μg/ml r HMGB1组>1%CSE组>空白组(P<0.05)4.2.2 CSE促进HMGB1刺激破骨细胞相关基因的表达1%CSE组>空白对照组>1μg/ml anti-HMGB1组(P<0.05);1%CSE+1μg/ml r HMGB1组>1%CSE组(P<0.05);1%CSE+1μg/ml r HMGB1组>1μg/ml r HMGB1(P<0.05)结论:1.吸烟加重牙周炎症2.吸烟促进牙周炎牙龈组织中HMGB1蛋白分泌,并促使HMGB1蛋白由细胞核转移到细胞质及细胞外,并促进HMGB1 m RNA表Bio-compatible polymer达3.HMGB1促进巨噬细胞分化为破骨细胞4.CSE促进HMGB1刺激巨噬细胞分化为破骨细胞