选题依据:阿尔茨海默症(AD)的主要病理特征是Aβ异常沉积以及神经纤维缠结,其会导致神经元丢失,引起认知功能障碍。近年来,异常免疫应答成为研究AD机制的热点,这一过程与中枢神经系统内的小胶质细胞有关。小胶质细胞在激活状态下,释放PGE2、IL-6等炎症因子以增强免疫反应,过度反应会导致神经炎症,从而引发AD等神经退行性疾病。小胶质细胞主要通过氧化磷酸化进行糖代谢,越来越多的证据表明,神经炎症的发生伴随氧化磷酸化向糖酵解途径的转变,加重AD的发生。因此,探明抑制糖酵解进而改善小胶质细胞神经炎症的潜在机制具有重要意义。黄芩素是一种重要的黄酮类化合物,来自唇形科植物黄芩的根部。课题组前期工作表明,黄芩素在D-半乳糖致大鼠模型和快速老化小鼠SAMP8模型中,显著改善认知功能障碍,同时,黄芩素在体外可以抑制小胶质细胞的神经炎症反应,但是黄芩素是否能通过调节糖酵解改善神经炎症的机制尚不清晰。因此,本研究采用LPS诱导BV-2细胞炎症模型,研究黄芩素通过调节糖酵解途径,从而改善LPS诱导BV-2细胞炎症反应的机制。目的:验证黄芩素对神经炎症的保护作用;探索黄芩素能否通过抑制糖酵解改善LPS诱导的BV-2细胞炎症;阐释黄芩素抑制糖酵解的作用机制。方法:1.通过测定细胞活力、NO水平,建立LPS致BV-2细胞炎症模型;同时通过rifampin-mediated haemolysis检测炎症因子IL-6、PGE2、TNF-α水平,COX-2蛋白表达水平以及ROS水平,考察黄芩素对LPS诱导的BV-2细胞的神经炎症的保护作用。2.采用~1H-NMR代谢组学技术,通过分析黄芩素调节的差异代谢物、代谢通路,并进行炎症因子和差异代谢物的相关性分析,阐明黄芩素抑制LPS致BV-2细胞炎症反应的机制。3.通过测定糖酵解相关酶HK、6-PFK、PK、LDH的活性,葡萄糖摄取水平,糖酵解代谢物乳酸、ATP以及NAD+/NADH水平,评价黄芩素对糖酵解的抑制作用。4.采用Western blot、免疫荧光等技术,探讨黄芩素对STAT3/c-Myc信号通路的作用,并进一步应用STAT3激活剂RO8191,考察黄芩素对STAT3/c-Myc通路蛋白以及糖酵解相关酶活性的影响。结果:1.根据细胞活力和NO释放水平的实验结果,确定LPS诱导BV-2细胞炎症模型的条件是1μg/m L LPS处理24 h,寻找更多基于此模型,发现0.2、1、5和25μM黄芩素能显著性抑制LPS诱导的BV-2细胞培养上清液中NO、IL-6、PGE2、TNF-α水平,可明显降低COX-2蛋白表达和ROS生成。因此,黄芩素对LPS致BV-2细胞炎症具有保护作用。2.~1H-NMR代谢组学分析显示,黄芩素对LPS诱导的BV-2细胞内10种差异代谢物有明显的调节作用,涉及的代谢途径包括糖酵解糖异生,丙酮酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等;相关性分析显示,糖酵解相关代谢物乳酸和丙酮酸与IL-6、PGE2、TNF-α显著相关,提示黄芩素抑制小胶质细胞神经炎症与糖酵解有关。3.在LPS诱导的BV-2细PR-171溶解度胞中,不同浓度的黄芩素和2-DG能显著抑制糖酵解关键酶HK、6-PFK、PK、LDH的活性,提高葡萄糖摄取、乳酸释放量和ATP含量,降低NAD+/NADH,表明黄芩素可显著抑制糖酵解。4.Western blot和免疫荧光测定结果显示,25μM黄芩素显著下调糖酵解通路相关蛋白c-Myc和GLUT1蛋白的表达,并抑制STAT3的磷酸化。通过加入STAT3通路激活剂RO8191,表明黄芩素能抑制STAT3/c-Myc信号通路抑制糖酵解,从而发挥对LPS致BV-2细胞神经炎症的保护作用。结论:黄芩素可通过抑制糖酵解改善LPS诱导的小胶质细胞神经炎症,其作用机制与抑制STAT3/c-Myc通路有关。