富含鸟嘌呤(G)的DNA序列可以通过Hoogsteen氢键形成特殊的DNA二级结构,即G-四链体。人类基因组的很多区域都存在这样的DNA序列,如端粒末端区域、原癌基因启动子区域、核糖体DNA区域以及内含子区域等,并且可以形成DNA G-四链体。许多原癌基因启动子区域的DNA序列如c-Myc、c-Kit 1、Bcl-2、VEGF、HIF-1a、KRAS、h TERT等~([1])参与了肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡和转移等生物学过程。这些DNA序列的过度表达促进了各种人类恶性肿瘤的形成,因此下调相应基因的转录和翻译是癌症治疗的有效方法。研究表明,存在于原癌基因启动子区域的G-四链体具有转录阻遏作用。因此小分子药物可以通过诱导并稳定原癌基因启动子区域的DNA G-四链体形成从而抑制原癌基因的转录和翻译,从而有望成为一种靶向G-四链体的抗肿瘤药物。天然产物是天然存在的小分子文库,可以用于筛选新的抗肿瘤靶向药物。黄连(coptis chinensis Franch)为我国著名的常用中药,本课题组基于G-四链体的生物学功能,旨在针对靶向G-四链Medicaid claims data体的抗肿瘤的黄连生物碱小分子及其衍生物的筛选,并研究了与G-四链体的相互作用机制,初步评价抗肿瘤作用。进一步地,基于DNA胶束递药系统,黄连生物碱及衍生物与核酸适配体A20-AS1411和Bcl-2siRNA联用,以提高黄连生物碱类的抗肿瘤效果。目的:1.从天然产物黄连生物碱中筛选原癌基因启动子区域DNA G-四链体的稳定剂。2.研究黄连生物碱及衍生物对G-四链体的选择性、稳定能力并评价与G-四链体的相互作用。3.初步评价黄连生物碱及衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用,进一步地,将DNA胶束递药系统应用于与核酸适配体和siRNA联用的黄连生物碱及衍生物,评价对肿瘤细胞增殖的抑制效果,探索其https://www.selleck.cn/products/ferrostatin-1.html作用机制。4.为开发黄连生物碱类抗肿瘤药物提供理论和研究基础。方法:1.从黄连生物碱中筛选原癌基因启动子区域DNA G-四链体的稳定剂。使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)筛选与DNA G-四链体作用的天然产物黄连生物碱,并考察黄连生物碱的浓度对黄连生物碱与DNA G-四链体结合的影响。2.研究黄连生物碱对PD0325901配制原癌基因G-四链体的特异性和亲和力。(1)通过Native PAGE、紫外吸光度和荧光发射光谱评价黄连碱对G-四链体的特异性,并以16条设计的双链DNA为对照。(2)使用紫外分光光度计测定在黄连生物碱及其衍生物作用下DNA G-四链体的熔点(T_m),根据T_m的变化值进一步评价黄连生物碱及其衍生物对G-四链体的稳定能力,并与对照组双链DNA比较。(3)使用等温滴定量热法(ITC)测定黄连生物碱及其衍生物与G-四链体结合的解离常数(K_d),比较不同黄连生物碱及其衍生物与G-四链体的亲和力。3.通过细胞实验初步评价单独的黄连生物碱及衍生物、用DNA胶束包载并与核酸适配体和siRNA联用的黄连生物碱及衍生物的抗肿瘤活性以及作用机制。(1)选用三阴性乳腺癌细胞4T1和MDA-MB-231、乳腺癌细胞MCF-7以及宫颈癌细胞He La,通过CCK-8法分别测定单独的黄连生物碱及衍生物、用DNA胶束包载并与核酸适配体和siRNA联用的黄连生物碱及衍生物的细胞存活率,评价对肿瘤细胞增殖的抑制效果。(2)使用Western Blot研究黄连生物碱及衍生物对肿瘤细胞c-Myc蛋白的下调作用,进而研究其抗肿瘤作用的机制。结果:1.Native PAGE结果表明,巴马汀、黄连碱和小檗碱与原癌基因G-四链体具有相互作用,特别地,与原癌基因G-四链体Pu22、c-Kit 1和Bcl-2的结合率高且结构稳定。黄连生物碱与对照双链DNA结合能力较弱,但结合时更易于与富含鸟嘌呤G的双链DNA结合。当黄连生物碱在极低浓度(60μM)时,与对照双链DNA几乎不结合。2.Native PAGE、紫外吸光度和荧光发射光谱结果表明,与对照双链DNA相比,黄连生物碱能特异性识别原癌基因G-四链体。3.DNA熔点(T_m)表明,不同黄连生物碱及其衍生物稳定G-四链体的能力远大于双链DNA,其T_m值变化值的顺序为Pu22>c-Kit 1>Bcl-2。对于不同黄连生物碱及其衍生物稳定同一G-四链体时,其T_m值变化值的顺序为黄连碱>巴马汀>小檗碱>3-乙氧基巴马汀>3-正丁氧基巴马汀。4.ITC实验结果表明,不同黄连生物碱及其衍生物和G-四链体的结合能力远大于与双链DNA,根据其解离常数K_d值可得到其结合能力顺序为黄连碱>3-乙氧基巴马汀>巴马汀>小檗碱>3-正丁氧基巴马汀。同一黄连生物碱与不同G-四链体结合时,其结合能力顺序为Pu22>c-Kit 1>Bcl-2。5.细胞增殖抑制实验结果表明,筛选得到的黄连生物碱及衍生物对4T1细胞的增殖抑制作用最弱,对MCF-7细胞和He La细胞作用一般,对MDA-MB-231细胞的作用最强,其中衍生物3-正丁氧基巴马汀对细胞的增殖抑制作用更强。Western Blot结果表明,黄连碱和3-正丁氧基巴马汀能抑制肿瘤细胞c-Myc蛋白表达,表明所筛选的黄连生物碱及其衍生物对肿瘤细胞的增殖抑制作用可能通过稳定原癌基因的G-四链体,从而抑制转录和翻译。6.将黄连生物碱及衍生物通过DNA胶束包载,并与适配体AS1411和Bcl-2siRNA联用后进行递送,其对细胞的增殖抑制作用进一步增强。结论:以生物靶分子为基础进行抗肿瘤药物先导化合物的筛选是抗肿瘤药物研究的热点之一。DNA G-四链体结构的发现和现代分子生物学技术对其与肿瘤关系的研究,为抗肿瘤药物的研发提供一个新的契机。本研究通过筛选得到了与原癌基因启动子区域G-四链体具有相互作用的小檗碱、巴马汀和黄连碱三个黄连生物碱。它们对G-四链体具有较好的选择性和稳定能力,其稳定能力大小为黄连碱>巴马汀>小檗碱,同一黄连生物碱对不同DNA序列的稳定能力大小为Pu22>c-Kit 1>Bcl-2>DNA双链,其对G-四链体的稳定能力远大于双链DNA。黄连生物碱与G-四链体结合力好,但不同的黄连生物碱对G-四链体的结合能力有所区别,其结合能力大小为黄连碱>巴马汀>小檗碱,同一黄连生物碱对不同DNA序列的结合能力为Pu22>c-Kit 1>Bcl-2>DNA双链,与G-四链体的结合能力远大于双链DNA,其ITC实验与DNA熔点实验结果一致。细胞实验表明,基于DNA胶束并与siRNA、适配体A20-AS1411联用的黄连碱及3-正丁氧基巴马汀对肿瘤细胞的增殖抑制作用比单独的强。巴马汀衍生物对肿瘤细胞的增殖抑制作用比巴马汀强,其大小为3-正丁氧基巴马汀>3-乙氧基巴马汀>巴马汀,表明在3位引入的碳原子个数越多,疏水性越强,其抗肿瘤活性越强。进一步研究表明,黄连生物碱及其衍生物可以通过抑制肿瘤细胞c-Myc蛋白表达而发挥抗肿瘤作用。本文对黄连生物碱及其衍生物的结构修饰特点与药效关系、以及通过DNA胶束包载并与核酸药物联用的研究,将为以G-四链体为作用靶点的黄连生物碱类抗肿瘤药物的开发提供理论和研究基础。