目的瘙痒是一种令人不愉快的能引起抓挠反应的主观感觉,是皮肤病最常见的一种症状。目前,主要应用抗组胺药治疗瘙痒,但是其并不能完全解决临床瘙痒问题,瘙痒的治疗还有待进一步完善。黧豆蛋白酶(Mucunain)是一种非组胺依赖性的致痒介质,其引发的皮肤瘙痒反应与慢性瘙痒相似,可以将其作为非组胺依赖性瘙痒研究的模型物质用于止痒药物的研发。Mucunain是从黧豆豆荚毛刺中提取的一种可以引发瘙痒的蛋白酶,鉴于从黧豆豆荚毛刺中大量提取Mucunain比较困难,本研究通过基因克隆表达与纯化技术,获得高纯度的重组黧豆蛋白酶(Recombinant Mucunain,rMucunain),对其进行生物活性验证、动物致痒活性评价以及对人皮肤上皮细胞模型的作用研究,旨在进一步对非组胺致痒介质黧豆蛋白Ferrostatin-1临床试验酶的作用有更深的认识,为以后相关止痒剂的研究及其临床治疗方面的应用打下相应的基础。方法(1)rMucunain的克隆表达与纯化。根据文献分析预测Mucunain的活性结构域(93～309),合成并构建原核重组表达质粒rMucunain-pET-28a(+)-Sumo;应用Ca Cl_2转化法将其转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,同时对表达和裂解条件进行一系列优化;融合蛋白His6-Sumo-rMucunain溶于8 M尿素后用SUMO蛋白酶进行酶切、Ni-NTA亲和层析柱纯化和透析复性,超滤除盐、浓缩及冻干后得到重组蛋白rMucunain;采用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳和肽质量指纹谱分析进行分子量及肽段序列鉴定。(2)rMucunain的活性验证及致痒效应研究。采用FLIPR高通量实时荧光检测系统观察内源性表达PAR2和PAR4受体的Hela细胞内Ca~(2+)浓度变化,检测rMucunain是否具有活性;在ICR小鼠颈背部皮内注射rMucunain,观察并记录小鼠在1 h内的抓挠次数,以及ELISA检测小鼠血浆中IL-6的含量变化,分析其致痒效应。(3)rMucunain对人皮肤上皮细胞模型的毒性作用研究。构建人角质形成细胞和成纤维细胞的共培养皮肤上皮细胞模型,研究rMucunain对其毒性作用:包括观察细胞形态的变化,MTS比色法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况,ELISA检测细胞内IL-6/8的分泌水平,DCF法检测胞内ROS的释放以及Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Caspase 3/8/9、Bax、Bad、Bid、NF-κB、Fas、CYLD和Bcl-2的表达量。结果(1)成功构建了原核重组表达质粒rMucunain-pET-28a(+)-Sumo,获得了主要以包涵体的形式存在的重组蛋白His6-Sumo-rMucunain,通过酶切、纯化以及复性等一系列步骤获得了纯度≥90%的rMucunain,产量达到50 mg/L。(2)FLIPR检测结果显示rMucunain刺激Hela细胞后可以引发明显持续的钙流变化,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和rMucunain的混合物作用于细胞后钙流无明显变化,表明重组蛋白rMucunain可以激活内源性的蛋白酶激活selleck合成受体2和4,具有生物活性;同时,ICR小鼠皮内注射rMucunain产生了明显的搔抓反应,血浆中Medium chain fatty acids (MCFA)IL-6的含量也发生了明显改变,表明rMucunain具有致痒活性。(3)rMucunain刺激皮肤上皮细胞模型的结果表明,rMucunain可引起细胞的形态发生明显改变,出现凋亡小体、胞浆起泡和细胞轻微脱落等现象;可抑制细胞增殖,并呈时间/剂量依赖性;流式细胞术检测结果证实了rMucunain可以诱导明显的细胞凋亡发生,早期/晚期细胞凋亡率随时间延长而增大;胞内IL6/8和ROS的释放呈时间依赖性增加;Western blot结果显示,Caspase 3表达增多,pro-Caspase3/8下降,CYLD表达下降,表明皮肤上皮细胞发生了凋亡而非坏死,Bad、Bax、Fas、Bid和NF-κB-p65的表达量均下降,提示rMucunain不是通过Bad/Bax通路诱导细胞凋亡。综上所述,推测rMucunain诱导的皮肤上皮细胞凋亡是通过Caspase8依赖的信号通路引起的,NF-κB可能在其中起重要作用;结论通过基因克隆表达技术获得具有生物学活性作用的重组蛋白rMucunain,并发现rMucunain可以抑制体外培养的皮肤上皮细胞增殖以及引起细胞凋亡。