酶是一种生物大分子,在酶的催化作用下,生物体内可发生各类催化反应,使细胞内错综复杂的代谢过程有条不紊的进行,反之,当酶含量异常时,会导致一系列疾病的发生。例如,弹性蛋白酶是一种重要的蛋白水解酶,能够催化分解酪蛋白、血红蛋白、血纤维蛋白和白蛋白等。人体内弹性蛋白酶含量异常时,会导致各类炎症疾病的发生,如急性肺损伤和阻塞性肺部疾病等。酪氨酸酶是一种氧化酶,可调selleck Naporafenib控黑色素的生成。酪氨酸酶在人体内的过量表达会导致黑色素瘤等疾病的产生,其代谢紊乱,会抑制黑色素的产生,从而导致白癜风等皮肤疾病。因此,开发一种高效的检测生物大分子的工具,对于相关疾病诊断具有重要意义。荧光分子探针技术具有操作简便,特异选择性好,灵敏度高,时空分辨率高,能够实时无损伤监测等优点,已被广泛用于分子检测、肿瘤诊断、生物活体成像等领域。其中,香豆素类荧光团具有易于修饰、斯托克斯位移大、光学性能稳定等特点,而被广泛应用于荧光探针的研究。因此设计合成基于香豆素衍生物的荧光探针用于检测生物大分子是一种重要的技术手段。本论文设计合成了以下三种荧光探针,并完成了分子水平、细胞水平及活体水平中酶含量的监测,内容简介如下:首先,设计并合成了一种新型的基于香豆素衍生物染料的荧光探针HFC-TYR。该探针可用于检测酪氨酸酶,以7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素为荧光团母体,在间羟基苄基的PET效应作用下,荧光发生淬灭,当与酪氨酸酶结合识别后,醚键断裂,PET效应被抑制,在505 nm处表现出强烈的荧光,www.selleck.cn/products/MK-1775即该探针为荧光增强Genetic reassortment型探针。HFC-TYR具有斯托克斯位移大(170 nm),荧光背景低、荧光检测限低(0.12 U m L~(-1))、选择性高等优点。此外,HFC-TYR已被成功用于活细胞和斑马鱼内源性酪氨酸酶的成像,并且可以区分肝癌细胞(Hep G2)和其他细胞(293T、HeLa和SKOV3)。表明HFC-TYR是一种可用于检测和成像酪氨酸酶的有效工具。其次,合成了基于香豆素衍生物的新型荧光探针(HNCOU-NE),该探针以香豆素衍生物HNCOU为荧光团母体,五氟丙酰基为识别基团,其荧光背景几乎为零,弹性蛋白酶会催化酰胺键断裂,从而使含氨基的荧光团释放,在535 nm处表现出强烈的荧光,达到检测弹性蛋白酶的目的。HNCOU-NE具有良好的检测性能,斯托克斯位移大(165 nm)、对弹性蛋白酶的亲和力高(K_m=5.04μM)、线性响应浓度宽(0～10 U m L~(-1))。此外,我们成功的使用探针HNCOU-NE监测Hep G2细胞中弹性蛋白酶活性,并且该探针实现了活体斑马鱼内源性弹性蛋白酶的检测和成像。最后,设计了一种含自断裂基团的新型荧光探针HFC-NE,可用于弹性蛋白酶的检测。在识别基团和自断裂基团的保护作用下,探针没有荧光,当与弹性蛋白酶反应后,首先酰胺键断裂,自断裂离团自发离去,荧光团HFC得以释放。探针HFC-NE具有检测限低(0.0109 U m L~(-1))、选择性高和响应迅速等优点。此外,HFC-NE的水溶性好,在弹性蛋白酶的存在下荧光信号增强176倍,具有良好的信噪比。HFC-NE已被成功用于活细胞和活体斑马鱼模型中内源性弹性蛋白酶的检测和成像,更重要的是,HFC-NE可用于区分HepG2细胞和其它细胞。表明HFC-NE具有弹性蛋白酶相关疾病诊断的潜在价值。