以酶为核心的生物催化技术是绿色生物制造的关键领域,广泛应用于多种精细化工产品的合成。利用廉价生物质资源为原料合成高附加值产品是实现绿色高效可持续发展的重要途径,然而以往的生物催化方式并不能在多样化的生物质原料应用中同时满足生物再生性以及生物相容性。近年来,基于微生物细胞表面自组装蛋白质支架系统的新型生物催化方式得到了广泛关注并表现出良好的应用前景。因此,选择兼具食品安全和工业鲁棒属性的微生物,作为开展表面自组装蛋白质支架系统研究的底盘细胞具有重要应用价值。本研究以建立谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032细胞表面自组装蛋白支架系统为目标,采用计算生物学和合成生物学相结合的策略,以两对可基因编码的彼此正交的谍蛋白反应对(Spy Catcher/Spy Tag)和探蛋白反应对(Snoop Catcher/Snoop Tag)为主要支架元件,最终构建了13种新型C.glutamicum细胞表面自组装蛋白质支架系统,并进一步验证其在不同的生物转化体系中的可操作性和应用能力。本研究的主要研究结果如下:(1)基于C.glutamicum细胞外膜的霉菌酸层,利用能够发生正交共价组装的谍化学反应对(Spy Catcher/Spy Tag),在C.glutamicum细胞表面开发由谍捕手结构域(Spy Catcher)组成的单种类蛋白质支架介导的自组装系统。通过锚定基序的适配性筛选,鉴定了5种不同锚定基序(Por B、Por C、Por H、Ncgl1337和Pgs A)对构建含有单一Spy Catcher结构域蛋白支架的影响,同时综合应用免疫细胞染色技术(IF)、激光共聚焦显微镜技术(CLSM)、流式细胞术(FACS)以及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,获得了具备在细胞外膜展示Spy Catcher结构域能更多力的3种锚定基序(Por B、Por C和Ncgl1337),并以绿色荧光探针(egfp-Spy Tag)作为模型蛋白考察细胞表面不同支架间的组装效率差异,结果表明以Por B为锚定基序的单位细胞表面荧光强度分别是Por C和Ncgl1337的1.2和1.3倍。在此基础上,考察了上述3种内源性霉菌anatomical pathology酸层蛋白的锚定位点通量变化对于构建该系统自组装效率的影响,构建了7株不同敲除组合的内源性霉菌酸层蛋白缺失的工程菌株,结果表明7种工程菌株的生长以及细胞形态受影响较小,但基因的敲除会造成Spy Catcher结构域蛋白支架的组装效率下降10%以上。因此,通过系统的锚定蛋白筛选以及细胞膜工程,成功开发了3种不同的Spy Catcher结构域组成的自组装蛋白支架系统。(2)为实现两酶催化体系在细胞表面可控组装,利用蛋白质结构模拟方法,在Spy Catcher/Spy Tag的基础上,进一步引入探化学反应对Snoop Catcher/Snoop Tag,成功在C.glutamicum细胞表面开发出多价态的Spy Catcher/Snoop Catcher共展示蛋白质支架系统。首先,基于常用的(GGGGS)_3接头序列构建Spy Catcher和Snoop Catcher结构域的数量为1:1的嵌合共展示支架,再次筛选适用于构建共展示蛋白支架的锚定基序,发现锚定基序Por B和Por C能够具备展示嵌合支架的能力,但嵌合支架中的Spy Catcher结构域的功能正常,而Snoop Catcher结构域的功能失活。随后运用蛋白质结构预测工具Apha Fold2-monomer模拟嵌合蛋白支架结构,揭示出接头序列(GGGGS)_3是造成嵌合蛋白支架的共展示功能失活的关键原因。紧接着通过理性设计将接头序列更换为ɑ-Helix,同时结合Alpha Fold2-multimer蛋白复合物模拟技术以及实验功能验证,获得了2种具有不同展示能力的嵌合蛋白支架。在此基础上,通过调整Spy Catcher和Snoop Catcher结构域的比例以及顺序,设计了具有可控化学计量的共展示蛋白支架,两种功能酶在共展示蛋白支架上的组装比例可达到1:1～1:3。(3)为实现单酶催化体系在细胞表面的高载量组装,利用合成生物学技术,设计含有不同数量(1～6)Spy Catcher结构域的长串联重复序列,在C.glutamicum细胞表面开发出定向组装单种类酶的高载量蛋白支架。定量结果研究发现,含有4个重复Spy Catcher结构域的蛋白支架在量效关系上效率最高,单位细胞绿色荧光探针的结合量是单个Spy Catcher结构域的1.8倍。随后,基于位点特异性重组酶Bxb1构建了“one input-two States”的双功能的逻辑门电路,分别实现State A和State B电路的两种表达方式独立运行。为进一步解决Bxb1渗透表达问题,精细调控基因表达电路,组合优化了Ssr A降解标签及核糖体结合位点(RBS)序列,使得State A电路的fold change达到29.7倍,State B电路的Fold change达到20.3倍。(4)基于不同的蛋白支架类型,结合两种不同的生物质资源为出发原料,设计生产两种不同功能糖的自组装蛋白支架系统的场景化应用,分别实现从麦芽糊精制备海藻糖的稳定性生产,以及从糖蜜到异麦芽酮糖的低价高效的可循环制备。首先,基于共展示支架,设计了双酶法生产海藻糖,经过转化条件优化,在10个独立批次的转化验证中,海藻糖的转化率一直稳定维持在69.9%-71.0%左右,相较于游离酶催化,生产稳定性大幅度提高。此外,在5 L发酵罐转化放大实验中,海藻糖的产率达到71.8%,海藻糖的质量浓度达到215.4 g/L,时空产率为14.36 g/L/h。随后,针对异麦芽酮糖的生产,首先基于酶工程强化蔗糖异构酶的工业属性,理性设计改造获得了稳定性提高的双酶突变体Pd SIV280L/S499F,突变体Pd SIV280L/SLorlatinib供应商499F的T_m值升高3.6℃。最后将突变体用于高载量的蛋白支架自组装催化系统中,并以50%(v/v)的糖蜜为出发原料,单批次催化可获得178.5 g/L的异麦芽酮糖,转化率达到87.3%,并可同步实现10批次的稳定性生产。